一种具有高抗氧化活性的生物活性肽及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种具有高抗氧化活性的生物活性肽及其制备方法与应用。

背景技术：

1、植物蛋白资源丰富、来源广泛，是制备生物活性肽的重要原料。植物蛋白源抗氧化肽因安全性高、易吸收、抗氧化活性明确等优势，在食品、保健品及医药领域具有广阔的应用前景。然而，现有植物蛋白源抗氧化肽的制备技术在蛋白前处理、活性残基暴露及酶解选择性等方面仍存在明显不足，制约了高抗氧化活性肽的精准制备与产业化应用。

2、现有技术普遍采用机械粉碎、碱溶酸沉、超声辅助等粗放手段处理植物蛋白原料。碱溶酸沉法依赖强酸强碱环境，易导致蛋白分子无规变性，破坏蛋白功能前驱体的高级结构；超声处理虽能提高提取率，但空化效应引起蛋白二级结构中α-螺旋和β-折叠比例降低，使蛋白结构从有序向无序转变；高温处理则使核桃蛋白等热敏性蛋白发生不可逆变性聚集。更为关键的是，上述手段均难以可控解离植物蛋白分子间形成的致密疏水聚集体，导致后续酶解效率低下、活性肽段释放不充分。

3、在蛋白舒展与活性残基暴露环节，现有技术手段较为单一。少数技术尝试通过加热或超声实现蛋白解聚，但仅依靠物理作用难以定向释放埋藏在疏水结构内部的抗氧化侧链。若直接采用强氧化处理（如过氧化氢体系），又容易造成氨基酸侧链氧化破坏，尤其会氧化消耗关键的巯基基团，产生次磺酸、亚磺酸等氧化产物，导致活性残基不可逆损失。

4、在酶解环节，现有技术多采用碱性蛋白酶、胰蛋白酶等广谱酶进行随机水解。此类酶无序列选择性，在释放抗氧化活性肽段的同时，也大量生成无抗氧化活性的惰性肽段和苦味肽，稀释了整体产物的抗氧化能力，且批次间活性波动大、产品纯度与功能专一性不足。

5、因此，亟需开发一种能够温和解聚植物蛋白聚集体、定向暴露抗氧化活性残基、精准富集抗氧化肽段的制备方法，以解决现有技术中存在的这些问题。

技术实现思路

1、要解决的技术问题：针对现有植物蛋白前处理粗放导致功能前驱体受损、活性残基暴露手段单一、广谱酶解无选择性导致抗氧化活性被稀释等问题，本发明的目的是提供一种具有高抗氧化活性的生物活性肽及其制备方法与应用，先采用低温梯度渗透压活化体系温和解聚植物蛋白分子间疏水聚集体，保全功能前驱体高级结构；再通过弱极性调控液构建弱极性微环境，定向暴露包埋的抗氧化活性残基，全程无氧化试剂参与，一级结构完整保留；最后采用特异性双酶定向酶解，精准富集高抗氧化活性肽段。本发明工艺温和可控，所制备的生物活性肽抗氧化活性显著提升，可广泛应用于抗氧化功能食品等领域。

2、技术方案：一种具有高抗氧化活性的生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：

3、s1.将植物蛋白原料加入活化体系中，于2-8℃恒温条件下搅拌30-40min，再进行三级梯度降渗后，静置10-15min，4℃、3000-5000r/min离心10-20min，取上清，得到预处理活化蛋白液；

4、s2.将预处理活化蛋白液逐步升温至32-35℃，在ph 6.8-7.2条件下，加入弱极性调控液，处理15-20min后，回调体系极性，得到残基暴露蛋白液；

5、s3.向残基暴露蛋白液中先加入木瓜蛋白酶进行酶解，灭酶，再加入风味蛋白酶酶解，灭酶、纯化、真空干燥，即得具有高抗氧化活性的生物活性肽。

6、进一步的，所述步骤s1中植物蛋白原料为核桃粕蛋白、大豆分离蛋白、豌豆蛋白、大豆蛋白、小麦蛋白或玉米蛋白中的任意一种。

7、进一步的，所述步骤s1中活化体系具体为：将3.2g/l nacl、0.08 g/l kcl、0.58g/l na2hpo4、0.1 g/l kh2po4、0.5-1.0%甘氨酸、0.1-0.2%氯化钾和0.2-0.4%肌醇共同溶解于纯水中，调节ph至6.9-7.3，无菌过滤，得到渗透压为300-320mosm/l的无菌活化体系。

8、进一步的，所述步骤s1中植物蛋白原料与活化体系的料液比为1:（8-12）。

9、进一步的，所述步骤s1中三级梯度降渗具体为：先将体系渗透压降至180-220mosm/l静置15-25 min，再降至120-150 mosm/l静置20-30min，最后降至70-105mosm/l静置25-35min。

10、进一步的，所述步骤s2中弱极性调控液为l-阿拉伯糖醇与丙二醇的混合溶液，质量比为（1-2）:1；所述预处理活化蛋白液与弱极性调控液的体积比为（10-20）:1。

11、进一步的，所述步骤s3中木瓜蛋白酶的酶活为50-150万u/g，以底物中蛋白质量计添加量为0.5-2.0%，50-60℃酶解60-90min。

12、进一步的，所述步骤s3中风味蛋白酶的酶活为500-1000 lapu/g，以底物中蛋白质量计添加量为0.5-1.0%，45-55℃酶解60-120min。

13、上述制备方法所制备的具有高抗氧化活性的生物活性肽。

14、上述生物活性肽在制备具有抗氧化功能的功能食品或保健食品中的应用。

15、有益效果：

16、本发明将植物蛋白原料加入温和等温活化体系中（无菌磷酸盐等渗缓冲体系为基底，添加甘氨酸-氯化钾复合低渗调节剂搭配肌醇），体系全程低温等温，仅松解蛋白高级聚集结构，对一级结构无损伤；再采用可控逐级降渗，保证体系温度、ph、极性稳定，仅调控渗透压，杜绝蛋白结构塌陷变性，具体实现方式如下：

17、①一级降渗：体系渗透压降至180-220 mosm/l静置15-25 min，初步撑开蛋白表层聚集结构；

18、②二级降渗：渗透压降至120-150 mosm/l静置20-30min，渗入蛋白内部致密折叠区，打断分子间疏水聚集与弱氢键交联；

19、③三级降渗：渗透压稳定至70-105mosm/l静置25-35min，蛋白致密纤维完全舒展，由蜷缩聚集态转化为舒展活化态，完成蛋白聚集体的构象解聚活化；

20、降渗完成后，维持解聚之后的原有溶剂环境10-15min，依靠体系内肌醇的界面缓冲效应，抑制舒展后的蛋白分子发生二次蜷缩、分子间疏水复聚，维持蛋白分散舒展状态，获得活性位点暴露、结构完整的蛋白前驱体溶液；最后进行温和除杂，使得解聚舒展过程中游离的内嵌脂类、微量致敏杂片段，通过低温低速离心脱除，获得预处理活化蛋白液；

21、本发明在梯度渗透压解聚活化完成后，在32-35℃、ph 6.8-7.2条件下，加入l-阿拉伯糖醇/丙二醇弱极性调控液以构建弱极性微环境，专门暴露被疏水口袋包埋的抗氧化活性残基（巯基、羟基、芳香侧链）；该调控液通过适度下调体系介电常数，选择性扰动蛋白分子内部疏水区域的弱氢键与疏水相互作用，不会造成肽键断裂，也不会引发氨基酸侧链的共价修饰，仅改变蛋白局部高级折叠状态，蛋白一级结构完整保留，使原本被空间位阻包裹的抗氧化残基充分暴露至分子表面；处理结束后经缓冲液稀释回调体系极性，再进入后续酶解工序；

22、本发明在得到残基暴露蛋白液后，采用顺序特异性双酶定向酶解，第一步先以木瓜蛋白酶优先切割疏水端，释放富含亮氨酸、脯氨酸的疏水抗氧化核心片段；第二步再加入风味蛋白酶，利用其外切活性从肽段氨基/羧基末端逐个切除冗余的非功能残基，规整肽段极性结构，暴露并保留亲水端自由基捕捉活性位点；避免同时直接加入复合酶带来的活性位点无差别破坏，最终获得具有高抗氧化活性的蛋白肽。