一种聚丙烯酰胺水凝胶梯度洗脱方法及发酵应用

本发明涉及高分子材料，具体地说，涉及一种聚丙烯酰胺水凝胶梯度洗脱方法及发酵应用。

背景技术：

1、丁酸梭菌为革兰氏阳性严格厌氧菌，广泛分布于养殖水体与水产动物肠道，能利用碳水化合物发酵产丁酸，同步分泌胞外消化酶并形成抗逆芽孢，投喂后可稳定定殖于肠道。定植后，丁酸作为核心功效物质，可重塑肠道菌群稳态、修复黏膜屏障、提高饲料消化吸收率，并增强鱼虾蟹等养殖动物的非特异性免疫，有效缓解肠炎、烂肠等常见病害。然而，在游离液态厌氧发酵过程中，悬浮菌体易随发酵液排出，导致反应器内生物量持续衰减，丁酸合成速率与批次稳定性显著下降，同时增加菌体回收成本、缩短连续生产周期，严重制约规模化制剂制备的效率与经济效益。

2、针对上述游离发酵的固有缺陷，引入微生物固定化技术以实现菌体截留，是破解瓶颈的关键路径。聚丙烯酰胺水凝胶是一类三维网状亲水高分子材料，机械强度高、结构稳定、孔隙与亲水性可调，可通过物理吸附实现对菌体的高效负载，其本身不提供微生物可直接代谢的营养成分，能够避免载体被微生物分解吸收的风险。

3、然而，常规方法制备的聚丙烯酰胺水凝胶内部网络孔道的连通性和比表面积存在局限性，不利于菌体的高效负载和传质，限制了其作为固定化载体的进一步应用。因此，如何对聚丙烯酰胺水凝胶的内部网络结构进行有效调控，使聚丙烯酰胺水凝胶获得更高的孔道连通性和比表面积，从而充分发挥其作为固定化载体的潜力，成为本领域亟须解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明提供了一种聚丙烯酰胺水凝胶梯度洗脱方法及发酵应用，其通过将聚合形成的初始水凝胶进行2-4次交替进行的控温水洗步骤和控温干燥步骤的梯度循环结构重塑处理，使水凝胶内部网络从初始聚合状态重塑为具有更高孔道连通性和比表面积的精细拓扑结构，从而解决上述背景技术中所提出的问题，即：

2、现有制备方法制得的聚丙烯酰胺水凝胶内部网络孔道连通性和比表面积存在局限性的问题。

3、为实现上述目的，本发明提供了一种聚丙烯酰胺水凝胶在丁酸梭菌产脂肪酸中的应用，将经梯度循环结构重塑处理后的水凝胶作为丁酸梭菌的固定化载体，应用于丁酸梭菌发酵产脂肪酸体系中，能够提升菌体吸附与定植效果、改善体系传质效率，从而提高脂肪酸产量。

4、本发明还提供了一种用于实现上述应用的聚丙烯酰胺水凝胶梯度洗脱方法，包括以下步骤：

5、s1、在无氧条件下，将丙烯酰胺单体、交联剂、引发剂和催化剂混合，聚合形成初始水凝胶；

6、s2、对所述s1中获得的初始水凝胶进行梯度循环结构重塑处理，所述处理包括2-4次交替进行的控温水洗步骤和控温干燥步骤；

7、其中，所述水洗步骤的温度为50-60℃，单次持续时间为20-120min；所述干燥步骤的温度为60-80℃，单次持续时间为5-30min；

8、所述交替进行的控温水洗步骤和控温干燥步骤共同作用，使得水凝胶内部网络从初始聚合状态重塑为具有更高孔道连通性和比表面积的精细拓扑结构。

9、需要说明的是，梯度洗脱方法是指通过梯度循环结构重塑处理对水凝胶内部网络进行调控的方法，具体表现为交替进行的控温水洗步骤和控温干燥步骤，从而形成具有更高孔道连通性和比表面积的精细拓扑结构。

10、上述技术方案中，梯度循环结构重塑处理的核心在于采用2-4次交替进行的控温水洗步骤和控温干燥步骤。该处理通过温度交替驱动水凝胶内部网络发生可逆的溶胀收缩循环：在控温水洗阶段，水凝胶吸收水分、高分子链段舒展，促使网络膨胀并打开原有致密孔道；在控温干燥阶段，水分部分脱除、链段收缩，形成新的网络交联点并固定孔道形态。

11、多次交替循环使水凝胶内部网络逐步从初始聚合状态重塑为具有更高孔道连通性和比表面积的精细拓扑结构，从而克服了常规方法制备的水凝胶内部孔道致密、连通性差、比表面积有限的固有缺陷。

12、上述梯度循环结构重塑处理中，控温水洗步骤的温度控制为50-60℃，单次持续时间为20-120min；控温干燥步骤的温度控制为60-80℃，单次持续时间为5-30min。

13、该温控范围的选择具有以下技术意义：水洗温度低于聚合体系的玻璃化转变温度，可确保水凝胶在溶胀状态下保持足够的链段活动性，同时避免高温导致网络不可逆破坏；

14、干燥温度略高于水洗温度，产生适度的温度梯度，驱动水分定向迁移并加速链段重排。水洗时间与干燥时间的差异化设计，使得每次循环中聚合物网络能够充分溶胀后再适度收缩，形成更为开放且相互连通的孔道结构。

15、2-4次循环的限定则是平衡处理效果与效率的结果：循环次数少于2次无法充分实现网络结构的重塑；循环次数超过4次则可能因反复溶胀-收缩导致网络疲劳或过度致密化，反而降低比表面积。

16、进一步地，所述控温水洗步骤的温度为55℃，所述控温干燥步骤的温度为70℃。

17、进一步地，将所述s2得到的水凝胶作为固定化载体，用于丁酸梭菌的厌氧发酵。

18、优选地，所述控温水洗步骤的单次持续时间为40min；所述控温干燥步骤的单次持续时间为10min。

19、更优选地，s1中，各组分用量如下：

20、丙烯酰胺单体，其质量为去离子水质量的64%；

21、n,n'-亚甲基双丙烯酰胺交联剂，其质量为去离子水质量的0.167%；

22、过硫酸钾引发剂，其质量为去离子水质量的0.4%；

23、四甲基乙二胺催化剂，其质量为去离子水质量的0.0417%。

24、更优选地，所述s1中，无氧条件是通过通入惰性气体实现的，所述惰性气体为氩气。

25、进一步的，将所述水凝胶作为丁酸梭菌的固定化载体，在35-39℃、100-140rpm的条件下进行厌氧发酵；

26、所述水凝胶与发酵培养基的体积比为1:1.5-1:3，发酵时间为24-48h。

27、更进一步的，发酵培养基包含以下组分：

28、胰蛋白胨，10g/l；

29、酵母膏，3g/l；

30、牛肉浸粉，10g/l；

31、葡萄糖，5g/l；

32、刃天青，0.001g/l；

33、氯化钠，5g/l；

34、半胱氨酸盐酸盐，0.5g/l；

35、乙酸钠，3g/l；

36、可溶性淀粉，1g/l；

37、余量为水，ph为7.0。

38、与现有技术相比，本发明的有益效果：

39、本发明采用物理吸附方式固定化丁酸梭菌，聚丙烯酰胺水凝胶不提供微生物可直接利用的营养成分，避免了海藻酸钠等天然载体在长期发酵过程中被微生物分解吸收的风险。

40、此外，经梯度循环结构重塑处理后的水凝胶具有优异的机械强度和形变恢复能力，能够适应长期厌氧发酵过程中的搅拌剪切力，确保载体结构的稳定性；基于上述结构优势，将其作为固定化载体，能够提升菌体吸附与定植效果、改善传质效率，从而大幅提高丁酸等脂肪酸的产量。