一种呼出气冷凝样本的微生物检测系统的制作方法

本发明涉及医疗器械与体外诊断，更具体地，涉及一种呼出气冷凝样本的微生物检测系统。

背景技术：

1、呼出气冷凝液（exhaled breath condensate, ebc）作为一种完全无创的呼吸道样本采集方式，能够反映气道内的微生物组成及气溶胶信息，特别适用于间质性肺病、风湿免疫病等长期接受免疫抑制剂治疗的高危人群，以及需要频繁采样以监测动态变化的临床场景。然而，尽管ebc具备重要的临床转化价值，其从收集到检测的全流程在实际应用中仍面临多重技术瓶颈，导致检测成功率低、结果不可靠，难以进入标准化临床诊断路径。现有的ebc采集装置（如rtube手持式ebc采集器（图2中的a）、ecoscreen（研究/临床研究常用冷凝平台）（图2中的b） 、国内便携式“呼出气冷凝液采集器/bioscreenii”类产品（图2中的c）等）主要解决了冷凝与收集的问题，但存在以下显著缺陷：

2、1、采集与检测流程割裂的问题：现有技术方案中，ebc采集装置与微生物检测系统彼此独立，样本在收集后，必须经过人工开盖、移液、转管、加样等开放操作步骤才能进入检测环节。对于ebc这种天然超稀释基质，其微生物载量远低于痰液或灌洗液，开放式人工操作可能引入外源污染（导致假阳性），或因管壁吸附、挥发、残留导致本就稀缺的样本发生显著损失（导致假阴性）。这种损失在低生物量条件下呈非线性放大效应，直接决定检测结果。

3、2、现有采集装置大多无法实现呼出气量、冷凝体积与收集效率的精准定量，冷凝效率易受环境温度、湿度及受试者呼气流量波动的影响，导致不同受试者之间、甚至同一受试者不同时间点的样本不具备定量可比性，无法满足临床的监测需求。

4、3、冷凝与检测环节之间流程不匹配。ebc基质缺乏细胞沉降载体且黏稠度低，无法采用传统的离心沉淀方式进行微生物富集，而现有的微生物检测平台（包括各类 poct 设备）多针对高生物量样本（如拭子、痰液）设计，其上样体积、纯化流程及扩增条件与 ebc“体积小、稀释度高、信号弱”的特性严重不匹配。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，针对现有ebc采集与检测流程相互分离、低生物量样本易受污染和损失影响的问题，提供一种呼出气冷凝样本的微生物检测系统，针对 ebc特殊理化性质，将采集、定量、富集、处理及检测整合为封闭式一体化流路的系统，以消除人工转移带来的污染与损失，并实现低生物量样本的定量控制与富集处理。

2、本申请公开一种呼出气冷凝样本的微生物检测系统，包括通过封闭式流路结构依次顺序连通的呼出气采集模块、冷凝与定量模块、微生物富集与预处理模块和微生物检测模块，

3、呼出气采集模块，用于无创采集受试者的呼出气；

4、冷凝与定量模块，与所述呼出气采集模块密封连接，用于将呼出气冷凝为冷凝液，并定量监测获得的冷凝液体积；当冷凝液体积达到预设阈值时，控制将所述冷凝液流入下游模块；

5、微生物富集与预处理模块，与所述冷凝与定量模块密封连接，用于接收并自动对所述冷凝液中的微生物进行富集和原位裂解，得到提升了微生物靶标浓度的冷凝液；

6、微生物检测模块，与所述微生物富集与预处理模块的输出端连通，用于对提升了微生物靶标浓度的冷凝液进行检测。

7、通过构建封闭式一体化样本流转架构，并针对性地引入微生物富集与预处理模块，本申请具有以下有益效果：

8、1、本申请通过封闭式流路结构，实现了从呼气采集、冷凝定量、微生物富集、原位裂解到最终检测的全程无人工开盖转移。这一设计从根本上阻断了外源污染引入的途径，并避免了低生物量样本在移液、转管过程中的管壁吸附与挥发损失。针对 ebc 样本微生物信号接近检测下限的特性，本系统最大限度地保留了有效样本量，将原本可能因微量损失导致的“假阴性”转化为可检出的“真阳性”，显著提高了检测成功率，从源头保障样本的完整性、阻断污染与损失，保证检测真实性。

9、2、本申请通过定量冷凝，实现可重复、可对比的标准化检测，本申请公开的系统在冷凝模块中集成了液量感应结构与自动控制系统，能够实时监测冷凝液体积，并在达到预设阈值时自动启动定量转移程序，这一机制确保了每次冷凝体积、上样量与检测条件高度一致，消除了因环境波动或人为操作差异导致的稀释效应不确定性，使得不同时间点、不同受试者的检测结果具备严格的定量可比性，满足临床纵向监测与多中心应用的数据一致性要求。

10、3、针对 ebc 样本微生物丰度极低的特点，本申请在封闭流路中设置专用的微生物富集与预处理模块，利用微滤结构与表面修饰技术（带电涂层及生物亲和层），在样本流经过程中高效截留并富集目标微生物，将其浓度提升至常规检测可识别范围。随后，通过集成的热裂解或化学裂解单元对富集后的微生物进行原位裂解，无需转移即可释放核酸模板。这种采用尺寸截留与亲和吸附双重富集机制的设计，不仅解决了传统离心法不适用于ebc的难题，还实现对超稀释样本实现高效原位富集，将微生物浓度提升至常规检测可识别范围，突破低丰度样本检测瓶颈。

11、4、系统采用 1–100 μl 微升级检测腔，配套优化的核酸检测、光学检测或电化学检测单元，适配 ebc小体积、弱信号基质特性，解决现有检测平台与 ebc 样本不兼容的问题。

12、5、本系统保留了ebc采集无创、无痛的优势，同时通过自动化集成降低了操作门槛，特别适用于老年、肺功能受损及免疫抑制等不宜接受侵入性取样（如支气管肺泡灌洗）的高危人群，为呼吸道感染的早期筛查、病原体谱评估及治疗反应监测提供了可靠的工具。

1.一种呼出气冷凝样本的微生物检测系统，其特征在于，包括通过封闭式流路结构依次顺序连通的呼出气采集模块、冷凝与定量模块、微生物富集与预处理模块和微生物检测模块，

2.根据权利要求1所述的呼出气冷凝样本的微生物检测系统，其特征在于，所述冷凝与定量模块包括冷凝腔体、液量感应结构、自动转移通道及控制系统；

3.根据权利要求1所述的呼出气冷凝样本的微生物检测系统，其特征在于，所述微生物富集与预处理模块包括集成式微流控芯片，所述微流控芯片内集成设置微流控富集腔和裂解单元；

4.根据权利要求3所述的呼出气冷凝样本的微生物检测系统，其特征在于，所述微滤结构的孔径为0.22-0.45μm。

5.根据权利要求3所述的呼出气冷凝样本的微生物检测系统，其特征在于，所述微滤结构表面依次修饰有带电涂层和生物亲和层；所述带电涂层用于通过静电吸附非特异性捕获微生物；所述生物亲和层固定有特异性抗体、凝集素或适配体，用于特异性捕获目标微生物。

6.根据权利要求3所述的呼出气冷凝样本的微生物检测系统，其特征在于，所述裂解单元包括热裂解组件和/或化学裂解组件。

7.根据权利要求6所述的呼出气冷凝样本的微生物检测系统，其特征在于，所述热裂解组件包括集成在所述微流控富集腔区域的微型加热器及温度传感器；所述化学裂解组件包括预埋在芯片流路中的冻干裂解试剂仓。

8.根据权利要求1所述的呼出气冷凝样本的微生物检测系统，其特征在于，所述呼出气采集模块包括依次连通的一次性咬嘴、单向阀以及防唾液回流腔；防唾液回流腔的流道横截面被扩大并设有唾液收集部，用于降低气流速度并使唾液液滴沉降。

9.根据权利要求1所述的呼出气冷凝样本的微生物检测系统，其特征在于，所述微生物检测模块包括容积为1–100 μl的检测腔，以及核酸检测单元、光学检测单元或电化学检测单元中的至少一种；检测腔通过零死体积接口与所述微生物富集与预处理模块的排液口连通。

10.根据权利要求1所述的呼出气冷凝样本的微生物检测系统，其特征在于，系统还包括与所述微生物检测模块电连接的结果输出模块，用于接收、显示、存储或传输检测结果及本次检测的样本体积信息。