重组马立克氏病病毒的制作方法

本发明涉及动物健康领域。具体而言，本发明涉及一种重组马立克氏病病毒（mdv），其基因组中包含至少一种异源核苷酸序列，其中所述至少一种异源核苷酸序列位于ul55和lorf10之间的位置或ul2和ul3之间的位置。此外，本发明提供了一种包含本发明重组mdv的免疫原性组合物以及该免疫原性组合物用于预防和/或治疗动物疾病的用途。

背景技术：

1、马立克氏病病毒（mdv）属于疱疹病毒科（herpesviridae）的α疱疹病毒亚科（alphaherpesvirinae）的马立克病毒属（mardivirus）。该病毒的基因组为双链线性dna，全长约180 kb，编码103种蛋白质。马立克氏病病毒可分为3种血清型。其中，血清型1病毒对鸡宿主具有致病性和致癌性。根据致病性和毒力，该病毒可进一步分为温和型mdv（mmdv）、强毒型mdv（vmdv）、超强毒型mdv（vvmdv）和超强毒+型mdv（vv+mdv）。血清型2马立克氏病病毒无致癌性，血清型3马立克氏病病毒对鸡无致病性。目前用于预防md的疫苗主要是血清型1减毒疫苗，包括荷兰cvi988株（rispens）和中国814株。

2、重组疱疹病毒活载体疫苗是一种经过深入研究的基因工程疫苗，具有广泛的应用前景。其原理是通过基因工程技术将某种病原体的保护性抗原基因插入到病毒载体的非复制必需区域，随着载体的复制，抗原持续表达，诱导机体产生相应的抗体，从而发挥免疫保护作用。重组活病毒疫苗的病毒载体可以自我复制，因此通常较低的剂量即可在体内产生足够的外源蛋白，产生持久且良好的免疫保护。重组病毒载体疫苗不仅可以诱导体液免疫，还可以诱导细胞免疫和黏膜免疫。与传统的灭活疫苗或减毒活疫苗相比，不同的重组病毒已被证明可以显著降低感染后的病毒脱落水平，并减少环境中的病毒载量。

3、对于mdv，血清型3火鸡疱疹病毒（hvt）和血清型1 mdv被认为是构建活载体疫苗的理想载体。这些病毒已被用作载体构建不同的重组病毒。li等人使用mdv 814疫苗株作为载体，成功构建了表达传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组mdv。研究表明，该重组病毒安全稳定，能够很好地保护鸡免受马立克氏病和传染性法氏囊病的侵害。

4、传染性喉气管炎（ilt）是由传染性喉气管炎病毒（iltv）引起的一种急性、高度传染性的上呼吸道感染。iltv属于α疱疹病毒亚科，是一种双链dna包膜病毒。病毒基因组约为155kb，主要包含120kb的长单一区域（ul）和17kb的短单一区域（us）。包膜糖蛋白gb、gd、gi和ge是iltv的主要免疫原性相关蛋白。它们位于病毒包膜表面，与病毒吸附和侵入宿主细胞有关，还可以诱导宿主产生相应的细胞免疫和体液免疫反应。目前，除了鸡场的生物安全措施外，疫苗接种是预防ilt的主要措施。然而，目前的减毒ilt疫苗存在毒力强、难以与野生株区分等缺点。此外，有报道称，不同减毒疫苗株之间可能发生重组，产生新的强毒病毒。因此，迫切需要开发新一代高效、安全的疫苗来预防和控制ilt。

5、新城疫（nd）是一种高度传染性的病毒性疾病，影响着世界各地的家禽和野生鸟类。该疾病由新城疫病毒（ndv）引起，ndv属于副黏病毒科（paramyxoviridae）副黏病毒属（paramyxovirus）。ndv是一种有包膜的、单链、负义、非分段基因组核糖核酸（ssrna）病毒。强毒株可导致全群毁灭。减毒株可引起鸡的呼吸道感染和产蛋量下降，但鸡可快速恢复。ndv在世界各地造成巨大的经济损失，是最有害的禽类病毒性疾病之一。ndv基因组编码六种病毒蛋白：l蛋白（大蛋白）、np（核蛋白）、p蛋白（磷蛋白）、m蛋白（基质蛋白）、hn（血凝素-神经氨酸酶）、f蛋白（融合蛋白）。其中，f蛋白主要参与病毒穿入、细胞融合、溶血等过程，同时具有较强的免疫原性，是制备新城疫疫苗的重要保护性蛋白。

6、h9n2禽流感是由正黏病毒科（orthomyxoviridae）a型流感病毒引起的一种急性、高度接触性传染病。aiv（禽流感病毒）属于正黏病毒科（orthomyxoviridae）正黏病毒属（orthomyxovirus）。病毒粒子多呈球形，直径为80至120纳米，表面覆盖有10至12纳米长的密集刺突或纤维，包括血凝素（ha）和神经氨酸酶（na）。病毒粒子在病毒包膜内具有螺旋核衣壳。aiv是一种单链负义rna病毒，其基因组由8个rna片段组成，编码不同的蛋白质。该病毒的基因组非常容易发生突变，ha基因的突变率很高，这是病毒抗原变异的主要原因。ha上的潜在糖基化位点是影响禽流感病毒毒力的可能因素之一。ha受体结合位点中的氨基酸可影响受体结合特性，从而改变病毒对细胞的亲和力和宿主范围。这可能是h9n2亚型禽流感病毒的毒力变异和感染谱不断扩大的真正原因。na基因的突变主要与病毒的成熟和释放密切相关，并可能影响病毒的复制和传播。自1994年报道首例h9n2病例以来，该病在中国已广泛流行，特别是在禽类种群密集的省份或地区。h9n2亚型禽流感是一种低致病性禽流感，但对家禽业危害极大。它不仅导致蛋鸡产蛋量严重下降，还增加了肉鸡和幼鸡复合呼吸道疾病的发病率和死亡率。它还能引起机体免疫抑制，导致鸡生长缓慢，给家禽业造成巨大的经济损失。

技术实现思路

1、在一个方面，本发明提供了一种重组马立克氏病病毒，其基因组中包含至少一种异源核苷酸序列，其中所述至少一种异源核苷酸序列位于ul55和lorf10之间的位置，或ul2和ul3之间的位置。

2、在一个方面，本发明提供了一种表达本发明重组病毒的宿主细胞。

3、在一个方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，包含本发明的重组病毒，以及可选的药学或兽医学上可接受的载体或赋形剂。

4、在一个方面，本发明提供了本发明的重组病毒在制备用于诱导宿主动物对病原体产生保护性免疫反应的免疫原性组合物中的用途，优选所述动物为禽类，更优选为家禽，如鸡。

5、在一个方面，本发明提供了本发明的重组病毒或本发明的免疫原性组合物用于在宿主动物中诱导对病原体的保护性免疫反应的方法，优选所述动物为禽类，更优选为家禽，如鸡。

6、在一个方面，本发明提供了一种在宿主动物中诱导对病原体的保护性免疫反应的方法，所述方法包括向动物施用本发明的重组病毒或本发明的免疫原性组合物，优选所述动物为禽类，更优选为家禽，如鸡。

1.一种重组马立克氏病病毒，其基因组中包含至少一种异源核苷酸序列，其中所述至少一种异源核苷酸序列位于ul55和lorf10之间的位置，或ul2和ul3之间的位置。

2. 根据权利要求1所述的重组病毒，其中所述重组病毒源自血清型1 mdv株，优选为减毒的血清型1 mdv株。

3. 根据权利要求2所述的重组病毒，其中所述血清型1 mdv株选自：荷兰cvi988株（rispens）、中国814株和sc9-2株。

4.根据权利要求3所述的重组病毒，其中所述重组病毒源自sc9-2株。

5. 根据权利要求4所述的重组病毒，其中所述重组病毒源自2023年12月15日保藏于cctcc、保藏号为cctcc no: v2023114的sc9-2株。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组病毒，其中所述至少一种异源核苷酸序列是目的多肽的表达盒。

7.根据权利要求6所述的重组病毒，其中所述表达盒包含目的多肽的编码核苷酸序列，该序列与表达调控元件（如启动子）可操作地连接。

8.根据权利要求6或7所述的重组病毒，其中所述目的多肽是抗原性多肽。

9.根据权利要求8所述的重组病毒，其中所述抗原性多肽是来自禽病原体的抗原性多肽。

10.根据权利要求9所述的重组病毒，其中所述禽病原体选自：新城疫病毒（ndv）、传染性法氏囊病病毒（ibdv）、传染性喉气管炎病毒（iltv）或禽流感病毒。

11.根据权利要求10所述的重组病毒，其中所述抗原性多肽选自：ndv的f蛋白、ibdv的vp2蛋白、iltv的gb蛋白、gd蛋白、gi蛋白和/或ge蛋白，或禽流感病毒的血凝素（ha）。

12. 根据权利要求7-11中任一项所述的重组病毒，其中所述启动子选自：鸡β-肌动蛋白（bac）启动子、pec启动子、鼠巨细胞病毒（mcmv）立即早期1启动子、人巨细胞病毒（hcmv）启动子、猿猴病毒（sv）40启动子、劳斯肉瘤病毒（rsv）启动子、iltv的gd天然启动子和iltv的gi天然启动子。

13.根据权利要求7-12中任一项所述的重组病毒，其中

14.根据权利要求1-13中任一项所述的重组病毒，其中

15.一种免疫原性组合物，包含根据权利要求1-12中任一项所述的重组病毒，以及可选的药学或兽医学上可接受的载体或赋形剂。

16.根据权利要求13所述的免疫原性组合物，其为疫苗，并且可选地包含佐剂。

17.根据权利要求1-14中任一项所述的重组病毒在制备用于诱导宿主动物对病原体的保护性免疫反应的免疫原性组合物中的用途，优选所述动物为禽类，更优选为家禽，如鸡。

18.根据权利要求17所述的用途，其中所述病原体选自：mdv、新城疫病毒（ndv）、传染性喉气管炎病毒（iltv）或禽流感病毒。

19.根据权利要求1-14中任一项所述的重组病毒或根据权利要求15或16所述的免疫原性组合物，用于在宿主动物中诱导对病原体的保护性免疫反应的方法，优选所述动物为禽类，更优选为家禽，如鸡。

20.根据权利要求19所述的用途的重组病毒或免疫原性组合物，其中所述病原体选自：mdv、新城疫病毒（ndv）、传染性喉气管炎病毒（iltv）或禽流感病毒。

21.一种在宿主动物中诱导对病原体的保护性免疫反应的方法，所述方法包括向动物施用根据权利要求1-14中任一项所述的重组病毒或根据权利要求15或16所述的免疫原性组合物，优选所述动物为禽类，更优选为家禽，如鸡。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述病原体选自：mdv、新城疫病毒（ndv）、传染性喉气管炎病毒（iltv）或禽流感病毒。