一种光交联脂质体水凝胶微粒及其在细胞共培养共分化中的应用

本发明涉及一种光交联脂质体水凝胶微粒及其在细胞共培养共分化中的应用，属于细胞培养。

背景技术：

1、随着组织工程、生物制造及细胞培养技术的快速发展，利用动物来源干细胞在体外构建具有特定结构和功能特征的三维组织模型已成为生命科学和生物医学领域的重要研究方向。天然肌肉组织通常由高度有序排列的肌纤维以及分布于其中的脂肪组织共同组成，肌肉细胞与脂肪细胞之间的空间分布、相互作用及成熟程度对于组织功能维持和微环境调控具有重要影响。因此，如何在体外实现肌肉细胞与脂肪细胞的协同培养，并构建具有空间异质性和功能特征的三维复合组织结构，是组织工程和生物制造领域亟待解决的关键技术问题。

2、近年来，模块化组织工程（modular tissue engineering）技术通过将不同类型细胞分别封装于具有特定功能的三维载体中，再通过模块化组装方式构建复杂组织结构，为模拟天然组织组成方式提供了新的技术策略。水凝胶微粒因具有良好的生物相容性、高含水率、可调节力学性能以及优异的细胞包埋能力，被广泛应用于细胞三维培养、组织构建及生物活性物质递送等领域。通过构建不同功能的水凝胶细胞模块，可分别提供适用于肌肉细胞和脂肪细胞生长分化的微环境，并进一步通过模块化组装形成具有多区域功能特征的复合组织结构。然而，传统水凝胶材料通常仅作为细胞支撑载体，缺乏对细胞行为和分化过程的持续调控能力，培养过程中所需诱导因子主要依赖外源添加方式，存在因扩散、降解导致局部有效浓度不足以及诱导效果不稳定等问题。

3、脂质体作为一种具有良好生物相容性的纳米递送载体，能够包载不同类型的功能性分子，并通过调控脂质组成实现活性物质的保护和持续释放。将脂质体与水凝胶体系结合构建复合递送平台，可实现功能分子的局部富集和时序释放，从而为细胞分化提供持续稳定的微环境调控。罗格列酮作为过氧化物酶体增殖物激活受体γ（pparγ）激动剂，可促进间充质干细胞向脂肪细胞方向分化，提高脂滴形成及脂质积累；胰岛素作为重要的代谢调节因子，不仅参与脂肪细胞分化和脂质代谢过程，还可通过激活pi3k/akt等相关信号通路促进肌肉细胞增殖、分化及蛋白质合成。因此，实现脂肪及肌肉分化相关功能分子的稳定递送，对于构建肌肉-脂肪复合组织具有重要意义。

4、目前，相关研究主要采用将诱导因子直接加入培养体系或通过载体进行递送的方法。然而，游离诱导因子容易受到培养环境影响而发生扩散、降解或失活，难以维持细胞周围长期稳定的刺激环境；传统脂质体递送体系也可能存在初始突释现象，导致局部因子浓度波动，影响细胞定向分化效率。因此，开发能够实现功能分子稳定负载、响应性释放以及细胞三维培养相结合的新型复合材料体系，对于提高组织构建效率具有重要意义。

技术实现思路

1、技术问题：

2、针对现有培养肉组织工程及肌肉-脂肪组织共培养体系中存在的细胞微环境调控能力不足、诱导因子利用率低、释放过程难以持续稳定以及肌肉组织与脂肪组织难以实现模块化构建等问题，本发明提供一种光交联脂质体水凝胶微粒的制备方法及应用。

3、现有技术中，肌肉干细胞和脂肪干细胞通常采用二维培养或直接混合三维培养方式，难以模拟天然雪花牛肉中肌肉组织与脂肪组织的空间分布；分化诱导因子主要通过培养基添加，存在扩散速度快、稳定性差、需频繁换液及局部浓度难以维持等问题，导致细胞分化效率和组织成熟度较低。同时，将生物活性因子简单包载于载体内部，容易产生突释现象，难以形成持续稳定的诱导微环境，限制了组织工程及培养肉构建的应用。

4、因此，亟需开发一种兼具细胞三维培养、分化因子持续递送及模块化组织构建功能的新型生物材料，实现肌肉干细胞和脂肪干细胞的高效共培养及定向分化，提高培养肉组织构建效率。

5、技术方案：

6、本发明提供一种基于光交联脂质体水凝胶微粒共培养肌肉细胞与脂肪细胞的方法，包括以下步骤：

7、（1）将大豆卵磷脂（spc）、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇(dope)、胆固醇半琥珀酸酯（chems），马来酰亚胺聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（dspe-peg-mal）、罗格列酮（ros）和溶剂混合，随后除去溶剂，得到ros@mal-sdcd脂质膜；再将ros@mal-sdcd脂质膜与含有胰岛素的pbs水溶液混合进行水合处理，随后用聚碳酸酯膜将水合后的混合体系重复挤出，获得包裹有罗格列酮和胰岛素且大小均匀的ros/ins@mal-sdcd脂质体；将ros/ins@mal-sdcd脂质体分散于pbs缓冲液中，加入巯基修饰胰岛素（ins-sh），避光反应，获得表面偶联胰岛素的脂质体（ins-lipo）；最后将冰片烯修饰壳聚糖、冰片烯修饰透明质酸、冰片烯修饰胶原蛋白（nor-col）、胰岛素修饰脂质体（ins-lipo）、交联剂、光引发剂以及去离子水混合，形成前驱液；将前驱液通过微流控方式，形成液滴，并进行光照交联固化处理，最终得到脂质体复合水凝胶微粒；

8、（2）将脂肪干细胞和肌肉干细胞分别接种于脂质体复合水凝胶微粒表面，随后混合组装，通过微粒间的界面结合以及细胞自身分泌的细胞外基质逐渐构建三维培养微环境，进行细胞共培养。

9、在本发明的一种实施方式中，步骤（2）中，接种的具体过程如下：

10、脂质体复合水凝胶微粒经灭菌后预先浸泡于完全培养基中，并于37 °c、5% co2条件下预平衡12–24 h；随后将脂肪干细胞或肌肉干细胞悬于完全培养基中，调整细胞浓度至1 × 106cells/ml，获得细胞悬液；每1 ml细胞悬液与200-800个直径为100-500 μm水凝胶微粒混合，使细胞接种密度控制在1 × 105cells/cm²，并置于亲水化处理的培养基表面；随后将培养板置于37 °c、5% co2培养箱中静置约2 h，使细胞黏附于水凝胶微粒表面。

11、在本发明的一种实施方式中，步骤（2）中，将脂肪干细胞接种于脂质体复合水凝胶微粒表面，所述脂质体复合水凝胶微粒在制备时，控制前驱液中冰片烯修饰壳聚糖与冰片烯修饰透明质酸的质量比为2:6。

12、在本发明的一种实施方式中，步骤（2）中，将肌肉干细胞接种于于脂质体复合水凝胶微粒表面，所述脂质体复合水凝胶微粒在制备时，控制前驱液中冰片烯修饰壳聚糖与冰片烯修饰透明质酸的质量比为4:4。

13、在本发明的一种实施方式中，步骤（2）中，混合组装时，表面接种脂肪干细胞的水凝胶微粒模块与表面接种肌肉干细胞的水凝胶微粒模块的数量比为1:2~2:1。具体可选1：2、1：1或2：1。

14、在本发明的一种实施方式中，步骤（1）中所述脂质体复合水凝胶微粒的制备方法采用ph响应性双载药脂质体与硫醇-降冰片烯光点击水凝胶相结合，实现罗格列酮（ros）和胰岛素（ins）的协同递送，并构建适用于培养肉组织工程的模块化三维培养体系；具体包括如下步骤：

15、s1、制备脂质体膜：将大豆卵磷脂（spc）、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇(dope)、胆固醇半琥珀酸酯（chems），马来酰亚胺聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（dspe-peg-mal）以及罗格列酮（ros）以一定比例充分溶解在氯仿溶液中并混匀，然后在40℃下真空旋转蒸发溶剂至干燥得到ros@mal-sdcd脂质膜；

16、s2、脂质体的合成：将干燥的ros@mal-sdcd脂质膜中加入含有胰岛素的pbs水溶液进行水合并超声处理10 min，再用聚碳酸酯膜将上述水合物重复挤出，获得包裹有罗格列酮和胰岛素且大小均匀的ros/ins@mal-sdcd脂质体；

17、s3、胰岛素的巯基修饰：将胰岛素溶解于pbs缓冲液（ph 7.4）中，加入适量traut's试剂（2-亚氨基硫烷盐酸盐），按一定摩尔比于4°c避光反应60 min，使胰岛素分子中的氨基转化为巯基。反应结束后，采用透析去除未反应试剂，获得巯基修饰胰岛素（ins-sh）。

18、s4、脂质体的胰岛素连接：将ros/ins@mal-sdcd脂质体分散于pbs缓冲液中，加入巯基修饰胰岛素（ins-sh），按预设摩尔比混合，在室温或4 ℃条件下避光反应2 h。反应过程中，ins-sh表面的巯基与脂质体表面的马来酰亚胺基团发生巯基-马来酰亚胺点击反应，形成稳定的硫醚键，实现胰岛素在脂质体表面的共价偶联。反应结束后，采用超滤去除未偶联的胰岛素，获得表面偶联胰岛素的脂质体（ins-lipo）。

19、s5、透明质酸钠、壳聚糖和胶原蛋白的降冰片烯修饰：将透明质酸钠溶解于 0.05m 醋酸溶液中，在室温下搅拌至完全溶解；胶原蛋白亦溶解于 0.05 m 醋酸溶液中，在 4 °c 下充分溶解。壳聚糖溶于 0.05 m 醋酸溶液中，经 1 m naoh 沉淀、多次水洗至中性后冷冻干燥并研磨成粉。随后，将5-降冰片烯-2,3-二羧酸酐溶解于 dmf 中，并在剧烈搅拌下滴加至多糖溶液中。反应在避光条件下4 °c进行 3 小时。反应结束后，对透明质酸钠和壳聚糖通过乙醇/dmf（1:1，体积比）沉淀回收，而胶原蛋白则直接进行透析。随后，将所得产物在去离子水或递减浓度 nacl 溶液中透析 2-3 天，每日多次更换透析液。纯化后的溶液最终冻干，并分别储存在 -20 °c（透明质酸钠与壳聚糖）或 4 °c（胶原蛋白）。

20、s6、脂质体水凝胶微粒的合成：配制不同终浓度的冰片烯修饰壳聚糖（nor-cs）和冰片烯修饰透明质酸（nor-ha）溶液。随后向各组溶液中加入hs-peg-sh作为交联剂、冰片烯修饰胶原蛋白（nor-col）、胰岛素修饰脂质体（ins-lipo）及光引发剂lap，充分混匀得到均一的水凝胶前驱液。根据nor-cs与nor-ha配比的不同，制备8组样品，分别记为lipo-cs4、lipo-cs2、lipo-c4h2、lipo-c4h4、lipo-c2h6、lipo-c2h4、lipo-c2h2和lipo-ha6，其余组分浓度保持一致。随后，将各组前驱液作为分散相注入微流控芯片，在连续相的剪切作用下形成尺寸均一的液滴，并在芯片出口处经405 nm光照诱导硫醇-降冰片烯（thiol-norbornene）点击反应实现快速原位交联固化，最终获得粒径约100-500 μm、粒径分布均一、球形度良好的脂质体复合水凝胶微粒。

21、在本发明的一种实施方式中，s1中，spc：dope：chems：dspe-peg-mal四种脂肪酸相对溶剂的总浓度为10-20 mg/ml。

22、在本发明的一种实施方式中，s1中，脂肪酸的投料比（摩尔比）为spc：dope：chems：dspe-peg-mal = 4：3：2：1。其中，ph敏感性脂肪酸dope和chems的总占比为50%。

23、在本发明的一种实施方式中，s1中，罗格列酮的投料比与脂肪酸总量的质量比为10-20:1。具体可选10：1，15：1和20：1。

24、在本发明的一种实施方式中，s2中，胰岛素与脂肪酸总量的质量比为20-40:1。具体可选20：1，30：1和40：1。

25、在本发明的一种实施方式中，s3中所述胰岛素的巯基修饰中，胰岛素与traut's试剂（2-亚氨基硫烷盐酸盐）的摩尔比例为1:10。

26、在本发明的一种实施方式中，s4中所述巯基胰岛素与马来酰亚胺的摩尔比为1:2。

27、在本发明的一种实施方式中，s5中，将5-降冰片烯-2,3-二羧酸酐溶解于 dmf 中，并在剧烈搅拌下分别滴加至透明质酸钠、壳聚糖或胶原蛋白的醋酸溶液中，同时维持反应液ph为9；避光条件下低温（4-10 °c）进行 1-3 小时；反应结束后，对透明质酸钠和壳聚糖通过乙醇/dmf沉淀回收，而胶原蛋白则直接进行透析；随后，将所得产物在去离子水中透析，多次更换透析液，纯化后的溶液最终冻干，分别制得降冰片烯修饰的透明质酸钠（nor-ha）、降冰片烯修饰的壳聚糖（nor-cs）、降冰片烯修饰的胶原蛋白（nor-col）。

28、在本发明的一种实施方式中，s5中所述的胶原蛋白的降冰片烯修饰中的通过如下方法制得：

29、。

30、在本发明的一种实施方式中，s5中所述的透明质酸的降冰片烯修饰中的通过如下方法制得：

31、。

32、在本发明的一种实施方式中，s5中所述的壳聚糖的降冰片烯修饰中通过如下方法制得：

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34、在本发明的一种实施方式中，s5中所述的降冰片烯修饰中的多糖可反应集团与5-降冰片烯-2,3-二羧酸酐的摩尔比例为1：2。

35、在本发明的一种实施方式中，s6中所述的脂质体水凝胶的合成中hs-peg-sh作为交联剂，使用浓度为10 mm。

36、在本发明的一种实施方式中，s6中，冰片烯修饰胶原蛋白（nor-col）的用量为0.5wt.%。

37、在本发明的一种实施方式中，s6中，胰岛素修饰脂质体（ins-lipo）及的用量为1wt.%。

38、在本发明的一种实施方式中，s6中，光引发剂为lap，用量为0.1 wt.%。

39、本发明还提供了上述方法获得的一种用于细胞共培养共分化的三维培养微环境。

40、本发明通过构建脂质体复合水凝胶微粒体系，将功能性脂质体与具有可调力学性能的水凝胶网络相结合，使其兼具细胞三维包埋、微环境调控以及活性分子持续释放等功能。在培养过程中，脂质体可响应细胞代谢产生的微环境变化发生结构调节并释放负载的功能分子，同时水凝胶网络逐渐降解并释放相关调控因子，从而为不同类型细胞提供持续性的生化刺激。此外，通过调节水凝胶组分比例，可构建具有不同力学特征的细胞培养模块，并进一步通过模块化组装方式实现肌肉细胞与脂肪细胞的空间协同培养和定向分化。

41、本发明提供了一种基于脂质体复合水凝胶微粒的多细胞共培养及组织构建体系，可用于构建具有肌肉-脂肪复合结构的三维组织模型。该体系不仅可应用于软组织工程、肌肉损伤修复、脂肪组织再生、组织模型构建及药物评价等领域，同时可为未来细胞培养肉及仿生食品结构构建提供新的技术方案。

42、本发明还提供了上述三维培养微环在肌肉-脂肪组织工程、生物制造领域中的应用。

43、本发明还提供了上述三维培养微环在再生医学以及功能性生物材料开发领域中的应用。

44、本发明取得的有益效果：

45、（1）本发明采用脂质体与天然高分子水凝胶复合构建光交联水凝胶微粒，兼具脂质体良好的载药性能和水凝胶三维支撑结构，可为细胞提供适宜的三维培养微环境，并提高活性因子的稳定性。

46、（2）本发明利用ph响应型脂质体负载罗格列酮和胰岛素，并结合水凝胶网络形成复合递送体系，可实现分化因子的局部缓释和持续释放，减少活性因子的快速扩散，提高诱导效率，有利于维持细胞分化所需的微环境。

47、（3）本发明将巯基修饰胰岛素通过硫醇-马来酰亚胺点击反应共价连接于脂质体表面，使胰岛素稳定固定于脂质体载体，提高其局部富集能力和稳定性，有利于促进肌肉干细胞和脂肪干细胞的持续分化。

48、（4）本发明采用微流控结合光交联技术制备尺寸均一的水凝胶微粒，制备过程温和、可控，所得微粒具有良好的形貌均一性、结构稳定性及生物相容性，便于细胞包埋和后续模块化组装。

49、（5）本发明采用水凝胶微粒分别构建肌肉干细胞模块和脂肪干细胞模块，实现肌肉组织与脂肪组织的模块化共培养，有利于模拟天然雪花牛肉中肌肉与脂肪交错分布的组织结构，可应用于培养肉组织工程、肌肉-脂肪组织构建、细胞共培养体系及功能性生物材料开发等领域。