一种茶树DREB2A基因在抗寒性dCAPS位点上的应用
背景技术：
1、茶树(camellia sinensis)是我国重要的经济作物，其生长发育对温度变化极为敏感。近年来，随着早生茶树品种的推广种植和气候变化的影响，春季"倒春寒"现象频发，导致茶树新梢冻伤、代谢紊乱，严重影响茶叶产量和品质。据统计，低温胁迫可使春茶减产20％-30％，造成巨大的经济损失。因此，深入解析茶树抗寒分子机制，开发高效的分子标记辅助育种技术，对培育抗寒茶树新品种具有重要意义。dreb(dehydration-responsiveelement binding)转录因子家族是植物响应低温胁迫的关键调控因子。其中，茶树dreb2a基因编码的蛋白含有典型的ap2/erf结构域，能够特异性结合dre/crt顺式作用元件，激活下游抗寒相关基因的表达。研究发现，dreb2a基因第3外显子存在一个与抗寒性显著相关的非同义突变位点(g/a)，该突变导致编码氨基酸由甘氨酸变为天冬氨酸，可能影响蛋白的dna结合活性。基于此突变位点，我们成功开发了一个dcaps分子标记系统。该标记采用特异性引物扩增含突变位点的基因组片段，通过限制性内切酶mspi酶切后，抗寒型基因型(gg)可被完全酶切产生两条带(120bp和80bp)，而敏感型基因型(aa)则保持完整的200bp条带。该dcaps标记具有以下优势：(1)共显性遗传，可准确区分纯合和杂合基因型；(2)操作简便，仅需常规pcr和琼脂糖凝胶电泳即可完成检测；(3)成本低廉，适合大规模样品分析。通过对50个茶树品种的基因型分析发现，该标记与田间抗寒性表型吻合度达85％以上，可作为茶树抗寒育种的有效辅助选择标记。这项研究不仅为茶树抗寒分子育种提供了新的技术手段，也为深入解析dreb2a基因在茶树低温响应中的调控机制奠定了重要基础。未来，该标记技术可广泛应用于茶树种质资源评价、杂交后代早期选择和分子标记辅助育种等领域，将显著提高茶树抗寒育种效率，推动茶产业可持续发展。
技术实现思路
1、针对现有技术中的不足，本发明提供了一种茶树dreb2a基因在抗寒性dcaps位点上的应用，以解决现有技术中筛选茶树抗寒新品种周期长及现有分子标记存在带型不稳定，特异性不强的问题，达到为茶树抗寒性品种分子辅助育种提供标记的目的。
2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、本发明的目的之一在于提供一种茶树抗寒性相关基因dreb2a的snp位点，所述snp位点位于茶树7号染色体第221282042位碱基，碱基多态性为c/t，所述snp位点为chr07:221282042_c/t。
4、发明人以‘铁观音’基因组为参考基因组，通过snp calling获得dreb2a基因的分子变异数据，利用r软件将分子变异数据与茶树品种的抗寒表型数据相关联，在dreb2a基因编码区获得了1个与茶树抗寒性状显著关联的非同义突变位点(chr07:221282042_c/t)。
5、本发明的目的之二在于提供一种茶树dreb2a基因在抗寒性dcaps位点上的应用，所述dcaps分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，上述snp位点位于所述核苷酸序列的第155位。
6、经实验验证比对，该非同义snp位点存在c碱基时，扩增片段只能被mbol酶切，当该snp突变为t碱基则不能被酶切，选择位于mbol的酶切位点的snp位点前、后大约500bp碱基序列转化为dcaps标记，dcaps标记的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7、本发明的目的之三在于提供扩增上述dcaps分子标记的引物，所述引物的序列如下：
8、正向引物序列：5'-ctgccaacttcccttattgttgtt-3'(seq id no.2)；
9、反向引物序列：5'-atgctcaagacgcaacaatcttact-3'(seq id no.3)。
10、本发明的目的之四在于提供一种使用上述dcaps分子标记和引物的检测方法，包括以下步骤：
11、(1)提取待测茶树样本dna；
12、(2)以待测茶树样本dna为模板，利用上述引物进行pcr扩增，得到扩增产物；
13、(3)利用限制性内切酶mbol对扩增产物酶切后电泳，得待测茶树样本电泳带型；
14、(4)带型比对与鉴定：若电泳带型为2条带，则待测茶树样本为snp位点为c，基因型为cc，鉴定待测茶树样本为抗寒性强的低温耐受品种；若电泳带型为3条带，则待测茶树样本为snp位点为杂合突变，基因型为ct，鉴定待测茶树样本为抗寒性中等的其他品种；若电泳带型为1条带，则待测茶树样本为snp位点为t，基因型为tt，鉴定待测茶树为样本抗寒性弱的低温敏感品种。
15、进一步地，每份步骤(2)中所述pcr扩增的反应体系包括：正向引物1μl，反向引物1μl，模板dna 1μl，2×rapid taq master mix 10μl，ddh2o 7μl。
16、进一步地，步骤(2)中所述pcr扩增的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
17、进一步地，每份步骤(3)中酶切体系包括扩增产物3μl，mbol 0.5μl，10×fastdigest green buffer 1μl，ddh2o 5.5μl；酶切条件为65℃孵育35min。
18、进一步地，步骤(4)中酶切结果显示低温耐受型的品种可以被酶切，切割成103bp和17bp片段，而低温敏感型的品种则不能被酶切，呈现一条120bp的片段。另外，抗寒性中等型的品种则呈现出120bp，103bp，和17bp三部分。
19、本发明的目的之五在于提供并要求保护上述snp位点、dcaps分子标记、引物在茶树抗寒性鉴定分型以及辅助选择育种中的应用。
20、本发明的目的之六在于提供并要求保护上述检测方法在茶树抗寒性鉴定分型以及辅助选择育种中的应用。
21、本发明涉及一种茶树dreb2a基因在抗寒性dcaps位点上的应用，属于分子标记技术领域。为了加速耐寒茶树种质创制与品种培育，本发明利用茶树群体重测序数据和基于snp的dcaps分子标记，分析突变位点的限制性酶切位点，筛选到特异性的内切酶mbol，通过酶切pcr产物、琼脂糖凝胶电泳、酶切片段分析等过程，对不同茶树品种进行了纯合(tt)、杂合(ct)和野生型(cc)酶切分型。相比现有技术，本发明的有益效果在于：
22、1.本发明在dreb2a基因编码区获得了1个与茶树抗寒性状显著关联的非同义突变位点(chr07:221282042_c/t)，开发出与抗寒性状紧密连锁的snp-dcaps分子标记，对鉴定茶树抗寒性具有较高的准确性。
23、2利用本发明的dcaps分子标记分别对6份不同抗寒性茶树品种进行验证，对96份不同抗寒性的茶树种质资源做进一步验证，结果表明，该分子标记与茶树抗寒性有显著或者极显著关联。这说明，利用本发明的dcaps分子标记进行茶树抗寒性鉴定具有简单快速，准确率高的优点。
24、3.利用本发明的dcaps分子标记对6份不同茶树幼苗进行抗寒基因型鉴定，并培育验证其成长后的抗寒性状，结果表明与幼苗期的基因型完全一致，说明利用本发明的dcaps分子标记可以为茶树育种材料的早期鉴定与选择提供新途径。
25、4.本发明提供的检测方法将筛选到的与茶树抗寒相关snp位点转化为dcaps标记，仅通过简单pcr、限制性内切酶酶切和琼脂糖电泳即可完成，处理方便、操作简单、重复性好，经济可靠。该方法能快速有效地进行茶树资源抗寒性评价，和辅助选择具有抗寒性的茶树新品种，缩短育种进程。
26、说明书附图
27、图1为dreb2a基因突变位点与茶树抗寒性状关联图。
28、图2为6份不同抗寒性茶树品种基因组dna扩增产物经限制性内切酶mbol酶切的凝胶电泳图，其中3、4泳道为低温耐受品种，5、6泳道为低温敏感品种，1、2泳道为其他品种。