基于磁纳米材料固定突变株的4-羟基苯丙酮酸合成方法与流程
本发明涉及基于磁纳米材料固定突变株的4-羟基苯丙酮酸合成方法，属于生物催化合成。
背景技术：
1、4-羟基苯丙酮酸（4-hpp）是酪氨酸代谢关键中间体，是医药领域合成相关药物的重要原料，也用于研究黑尿症等代谢疾病；同时作为精细化工中间体，可参与多种高附加值化合物合成，具有重要的实际应用价值。目前，4-羟基苯丙酮酸的合成主要依赖化学合成法和生物催化法，化学合成法存在反应条件苛刻、副产物多、环境污染严重等问题；传统生物催化法多采用野生型酶或游离工程菌作为催化剂，存在催化效率低、酶稳定性差、催化剂难以回收利用、反应体系中有缓冲液离子与有毒诱导剂等缺陷，限制了其工业化应用。
2、l-氨基酸脱氨酶（laad）可催化l-氨基酸脱氨生成对应的α-酮酸，是合成4-羟基苯丙酮酸的理想生物催化剂，其中粘质变形杆菌来源的
pmylaad具有广谱底物特异性，但野生型
pmylaad存在底物通道构象灵活性受限、fad辅因子结合亲和力弱等问题，催化效率较低。
3、同时，全细胞生物催化的工业化应用面临催化剂成本高、下游处理复杂、循环利用性差等挑战，磁性纳米固定化技术可实现催化剂的快速分离与回收，是解决上述问题的有效手段，但现有磁性载体存在细胞吸附效率低、固定化后酶活性保留差等问题。此外，传统生物催化体系依赖磷酸盐、tris-hcl 等缓冲液，且采用iptg作为诱导剂，iptg具有细胞毒性，限制了其规模化应用。
4、因此，如何提高l-氨基酸脱氨酶的催化效率、降低全细胞催化剂的生产成本、实现反应体系的绿色化，具有重要的研究意义。
技术实现思路
1、现有4-hpp生物催化合成存在野生型
pmylaad 催化效率低、游离工程菌无法循环利用、传统固定化载体吸附与分离效果差、反应体系依赖有毒诱导剂和缓冲液，且缺乏工业化放大方案的技术难题，难以满足规模化绿色生产需求。为实施上述问题，本发明通过酶工程、磁纳米固定化与绿色体系集成创新，获得高效
pmylaad突变体，构建高吸附性fe3o4@pda@pei载体及稳定固定化催化剂，实现无缓冲液、无毒性诱导的绿色催化，实现4-hpp高产与催化剂高效循环。
2、本发明的第一个目的是提供一种l-氨基酸脱氨酶突变体，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为将氨基酸序列如seq id no .1所示的l-氨基酸脱氨酶的第315位亮氨酸突变为丙氨酸；
3、或将氨基酸序列如seq id no .1所示的l-氨基酸脱氨酶的第73位谷氨酰胺突变为天冬酰胺；
4、或将氨基酸序列如seq id no .1所示的l-氨基酸脱氨酶的第415位苏氨酸突变为半胱氨酸；
5、或将氨基酸序列如seq id no .1所示的l-氨基酸脱氨酶的第73位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，同时将第315位亮氨酸突变为丙氨酸；
6、或将氨基酸序列如seq id no .1所示的l-氨基酸脱氨酶的第315位亮氨酸突变为丙氨酸，同时将第415位苏氨酸突变为半胱氨酸；
7、或将氨基酸序列如seq id no .1所示的l-氨基酸脱氨酶的第73位谷氨酰胺突变为天冬酰胺、第315位亮氨酸突变为丙氨酸，同时将第415位苏氨酸突变为半胱氨酸；
8、或将氨基酸序列如seq id no .1所示的l-氨基酸脱氨酶的第73位谷氨酰胺突变为天冬酰胺、第315位亮氨酸突变为丙氨酸、第415位苏氨酸突变为半胱氨酸，同时将第289位精氨酸突变为色氨酸；
9、或将氨基酸序列如seq id no .1所示的l-氨基酸脱氨酶的第73位谷氨酰胺突变为天冬酰胺、第315位亮氨酸突变为丙氨酸、第415位苏氨酸突变为半胱氨酸，同时将第71位酪氨酸突变为精氨酸；
10、或将氨基酸序列如seq id no .1所示的l-氨基酸脱氨酶的第73位谷氨酰胺突变为天冬酰胺、第315位亮氨酸突变为丙氨酸、第415位苏氨酸突变为半胱氨酸，同时将第252位亮氨酸突变为酪氨酸；
11、或将氨基酸序列如seq id no .1所示的l-氨基酸脱氨酶的第73位的谷氨酰胺突变为天冬酰氨，第315位亮氨酸突变为丙氨酸，第415位苏氨酸突变为半胱氨酸，第289位精氨酸突变为色氨酸，第71位酪氨酸突变为精氨酸，同时将第252位亮氨酸突变为酪氨酸。
12、在一种实施方式中，将氨基酸序列如seq id no .1所示的l-氨基酸脱氨酶的第73位谷氨酰胺突变为天冬酰胺、第315位亮氨酸突变为丙氨酸，同时将第415位苏氨酸突变为半胱氨酸后的突变体
pmylaad-l315a/q73n/t415c（m2）的氨基酸序列如seq id no .3所示。
13、在一种实施方式中，将氨基酸序列如seq id no .1所示的l-氨基酸脱氨酶的第73位的谷氨酰胺突变为天冬酰氨，第315位亮氨酸突变为丙氨酸，第415位苏氨酸突变为半胱氨酸，第289位精氨酸突变为色氨酸，第71位酪氨酸突变为精氨酸，同时将第252位亮氨酸突变为酪氨酸后的突变体
pmylaad-l315a/q73n/t415c/r289w/y71r/l252y（m4）的氨基酸序列如seq id no .4所示。
14、本发明的第二个目的是提供一种酶催化剂，是以以下形式中的任意一种：
15、（1）培养含有上述所述的l-氨基酸脱氨酶突变体的重组表达转化体，分离含有重组l-氨基酸脱氨酶突变体酶的转化体细胞；
16、（2）培养含有上述所述的l-氨基酸脱氨酶突变体的重组表达转化体，分离含有重组l-氨基酸脱氨酶突变体酶的转化体细胞，对含有重组l-氨基酸脱氨酶突变体酶的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液；
17、（3）培养含有上述所述的l-氨基酸脱氨酶突变体的重组表达转化体，分离含有重组l-氨基酸脱氨酶突变体酶的转化体细胞，对含有重组l-氨基酸脱氨酶突变体酶的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液，将重组l-氨基酸脱氨酶突变体酶的细胞破碎液经冷冻干燥而得到的冻干酶粉。
18、本发明的第三个目的是提供携带含有上述所述l-氨基酸脱氨酶突变体的基因的重组载体。
19、本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌表达了上述所述的l-氨基酸脱氨酶突变体。
20、在一种实施方式中，所述基因工程菌包括大肠杆菌基因工程菌、枯草芽孢杆菌基因工程菌、谷氨酸棒杆菌基因工程菌、酵母菌基因工程菌。
21、本发明的第五个目的是提供一种固定化生物催化剂，由上述任一所述的基因工程菌使用磁性纳米载体固定化处理得到，包括以下步骤：
22、（1）将上述任一所述的基因工程菌种子液按照1~5 %（v/v）的接种量接种至发酵培养基中于30~37℃、200~220 rpm培养至od600为0.6~0.8，随后加入诱导剂再于16~20℃下发酵12~24 h，随后离心、洗涤收集得到工程菌菌体；
23、（2）将步骤（1）制备得到的工程菌菌体重悬至od600为0.5~1后与1~2 mg/ml的磁性纳米载体以1：（1~3）的体积比混合后结合1~3 h，磁分离收集结合产物，洗涤得到fe3o4@pda@pei-工程菌固定化生物催化剂。
24、在一种实施方式中，所述诱导剂可为iptg或乳糖，可选地，发酵培养基中iptg的终浓度为5~8 mm；乳糖的终浓度为10~15 g/l。
25、在一种实施方式中，所述离心为8000~10000 rpm离心5~10 min。
26、在一种实施方式中，所述磁性纳米载体为fe3o4@pda@pei 磁性纳米载体，fe3o4@pda@pei磁性纳米载体的制备方法为：
27、将fe3o4纳米颗粒分散于tris-hcl缓冲液中超声得到fe3o4悬液；向fe3o4悬液中加入多巴胺溶液，搅拌后磁分离、洗涤得到fe3o4@pda中间体；将fe3o4@pda中间体分散于去离子水中，与聚乙烯亚胺溶液混合后搅拌，磁分离、洗涤得到fe3o4@pda@pei 磁性纳米载体。
28、在一种实施方式中，fe3o4@pda@pei 磁性纳米载体的制备方法为：
29、将纳米颗粒与tris-hcl缓冲液以8~12 mg：8~12 ml的比例混合后超声120~160min得到fe3o4悬液；将fe3o4悬液与0.5~0.8 mg/ml的多巴胺溶液以1~1.5：1~1.5的体积比混合后于20~30℃、250~350 rpm搅拌6~9 h，磁分离、洗涤得到fe3o4@pda中间体；将fe3o4@pda中间体分散于水中配置成1~1.5 g/ml的fe3o4@pda中间体水溶液，并与浓度为20~25 %（w/v）的pei溶液以1~1.5：1~1.5的体积比混合后搅拌8~12 h，磁分离、洗涤得到fe3o4@pda@pei 磁性纳米载体。
30、本发明的第六个目的是提供一种制备4-羟基苯丙酮酸的方法，以l-酪氨酸为底物，采用上述任一所述基因工程菌的全细胞或其细胞裂解液，或上述任一所述的固定化生物催化剂催化得到4-羟基苯丙酮酸；
31、具体方法为：以水或缓冲液为反应介质，向反应介质中投加终浓度为20~50 g/l的l-酪氨酸作为底物，投加终浓度为20~50 g/l上述任一所述基因工程菌的全细胞或其细胞裂解液或上述任一所述的固定化生物催化剂作为催化剂进行催化反应，离心得到含有4-羟基苯丙酮酸的上清液。
32、在一种实施方式中，所述催化的条件为ph6.5~7.5，温度25~30℃下200~220 rpm反应24~94 h。
33、本发明的第七个目的是提供上述任一所述基因工程菌或上述任一所述方法在制备4-羟基苯丙酮酸或含有4-羟基苯丙酮酸产品中的应用。
34、有益效果
35、（1）本发明通过对
pmylaad基因进行定点突变筛选得到了能够高效催化l-酪氨酸生成4 - 羟基苯丙酮酸（4-hpp）的突变菌株m2以及m4；使用m4催化合成4-hpp时，4-hpp的产量可达到19.01 g/l。
36、（2）本发明采用m4制备得到的固定化生物催化剂催化合成4-hpp时的初始转化率可达到82%，且可循环利用9次以上且仍保留超50%活性；反应体系采用自来水替代缓冲液、乳糖替代有毒iptg，绿色环保、成本低廉；催化剂可通过磁场快速分离，操作简便，下游处理简单，适合工业化大规模生产，在医药、精细化工等领域具有重要的应用前景。