一种在单细胞分辨率下检测模式特异性RNA-染色质相互作用的方法

本发明涉及rna-染色质相互作用检测，尤其涉及一种在单细胞分辨率下检测模式特异性rna-染色质相互作用的方法。

背景技术：

1、染色质相关rna（chromatin-associated rnas，carnas）是一类通过直接或间接作用与染色质结合的rna分子，它们是构建高级染色质空间结构、协调基因表达程序的核心调控因子。这类rna通过介导染色质构象变化、招募特异性表观遗传修饰因子（如组蛋白修饰酶）以及桥接远端增强子与启动子等机制，精确调控关键的转录网络。其功能紊乱已被证实与癌症、神经发育障碍及自身免疫性疾病等多种病理过程密切相关。从分子机制上看，许多rna-染色质相互作用由rna:dna杂交结构（如r-loop）作为支架，其动态形成与稳定受到rna结合蛋白及特定染色质修饰（如组蛋白修饰如h3k27ac、h3k4me3等以及dna甲基化修饰）的精密调控。尽管近年来技术发展深化了对rna修饰作用的认识，但关于“特定的染色质修饰如何主动引导并稳定rna-染色质的空间互作”这一根本性问题，仍存在巨大的认知空白。

2、现有技术手段的局限是阻碍该领域突破的主要瓶颈。虽然表观基因组学与单细胞技术的成功整合（例如scatac-seq、sccut&tag）已彻底改变对细胞异质性的理解，但现有方法仍难以系统性地解析一个核心生物学问题：在复杂的组织微环境中，染色质相关rna如何与特定的表观遗传效应因子协同，驱动具有细胞类型或状态特异性的病理基因表达程序。传统群体水平（bulk）的检测技术只能提供细胞群体的平均信号，无法揭示细胞间的异质性，而许多疾病的发生与发展，恰恰源于少数关键细胞亚群的功能异常。因此，在单细胞分辨率下实现对“模式特异性”（即由特定表观遗传修饰引导的）rna-染色质相互作用的系统性捕获，已成为理解生命过程精细调控和疾病发生机制的迫切需求。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种在单细胞分辨率下检测模式特异性rna-染色质相互作用的方法。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

3、提供一种在单细胞分辨率下检测模式特异性rna-染色质相互作用的方法，包括以下步骤：

4、步骤一，制备单细胞悬液；

5、步骤二，组互作模式特异性标记处理：将单细胞与靶向特定互作模式的一抗孵育；洗涤后，与经标记的f(ab')2-寡核苷酸偶联物结合，所述偶联物由特异性结合所述一抗的f(ab')2片段与带有生物素修饰的寡核苷酸连接而成；进行寡核苷酸杂交，所述偶联物只有在同时识别互作模式以及目标rna时，才可以最终保留在目标相互作用位点；

6、步骤三，染色质片段化：将完成抗生物素抗体孵育的细胞再与pa-tn5转座酶复合物孵育，以进行原位染色质片段化，并插入末端与细胞条形码互补的序列；

7、步骤四，单细胞液滴封装：将单细胞核悬液、含有细胞条形码的凝胶微珠、预扩增试剂和液滴生成油加载至微流控芯片，生成同时包裹单个细胞核和单个凝胶微珠的液滴，实现单细胞捕获；

8、步骤五，液滴内预扩增：对所述液滴进行热循环反应，在每个液滴内实现细胞条形码标记及目标片段的指数富集；

9、步骤六，破乳并回收核酸：破碎所述液滴，回收带有条形码标记的核酸；

10、步骤七，数据采集与分析

11、对回收的核酸进行测序，基于细胞条形码和唯一分子标识符进行数据预处理和比对，并按以下流程分析：

12、基于dna片段的核小体比率、双联体评分及片段长度分布进行质量控制；对高质量细胞进行降维和无监督聚类；对细胞亚群进行启动子区域信号富集分析；对目标细胞亚群进行拟时序分析；将单细胞rna测序数据与本方法获得的dna表观信息进行跨模态整合；以及在全基因组范围鉴定rna-染色质互作关系和/或对单个rna进行高分辨率结合位点鉴定。

13、进一步地，步骤二中所述特定互作模式为至少选自组蛋白修饰、染色质互作蛋白、dna修饰、染色质构象的一种。

14、进一步地，步骤二中所述f(ab')2-寡核苷酸偶联物由f(ab')2片段与寡核苷酸通过5′端氨基经双功能交联剂共价连接，且所述寡核苷酸的3′端及序列内部多个碱基上带有生物素修饰。

15、进一步地，步骤三中所述pa-tn5转座酶复合物的终浓度为0.5-2nm；所述原位染色质片段化是在35-37℃孵育45-60分钟。

16、进一步地，步骤五中所述热循环反应的条件为：98℃预变性3分钟；98℃变性15秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟，进行16个循环；最后72℃终延伸5分钟。

17、还提供上述的方法在非疾病诊断目的的细胞亚群异质性分析或单细胞rna-染色质互作图谱构建中的应用。

18、进一步地，所述应用包括检测h3k27ac修饰相关的rna-染色质相互作用在不同免疫细胞亚群中的分布。

19、本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

20、本发明通过将模式特异性互作捕获技术与高通量微流控单细胞技术相结合，能够在单细胞分辨率下绘制由特定表观遗传模式（例如蛋白质等大分子、结构依赖性的和染色质修饰）所介导的rna-染色质相互作用图谱。该方法实现了对上述修饰引导下rna-染色质互作的细胞特异性模式的解析，为研究复杂生物系统中的调控机制和疾病发生发展机理提供了有效的技术手段。

1.一种在单细胞分辨率下检测模式特异性rna-染色质相互作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所述特定互作模式为至少选自组蛋白修饰、染色质互作蛋白、dna修饰、染色质构象的一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所述f(ab')2-寡核苷酸偶联物由f(ab')2片段与寡核苷酸通过5′端氨基经双功能交联剂共价连接，且所述寡核苷酸的3′端及序列内部多个碱基上带有生物素修饰。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中所述pa-tn5转座酶复合物的终浓度为0.5-2nm；所述原位染色质片段化是在35-37℃孵育45-60分钟。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤五中所述热循环反应的条件为：98℃预变性3分钟；98℃变性15秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟，进行16个循环；最后72℃终延伸5分钟。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法在非疾病诊断目的的细胞亚群异质性分析或单细胞rna-染色质互作图谱构建中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括检测h3k27ac修饰相关的rna-染色质相互作用在不同免疫细胞亚群中的分布。