基于PC5B识别基序的靶向融合蛋白及其应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，具体地，涉及基于pc5b识别基序的靶向融合蛋白及其应用。

背景技术：

1、car-t细胞治疗在临床肿瘤干预中已展现出优异的抗肿瘤疗效，但传统car-t细胞在制备、运输等关键环节存在诸多局限，极大制约了细胞治疗技术的临床普及与广泛应用。原位car（in vivo car）技术的兴起，突破了传统car-t的技术壁垒，重塑了细胞治疗的发展格局，有望大幅降低治疗门槛，让细胞治疗技术普惠更多普通患者。

2、目前，in vivo car研发领域的主流递送系统主要为脂质纳米颗粒（lnp）体系与慢病毒体系。其中，慢病毒递送体系可通过突变失活糖蛋白结合结构域、保留功能性融合结构域，并在病毒包膜表面引入anti-cd3、anti-cd8、anti-cd7等特异性靶向抗体，实现对靶细胞的精准特异性感染。

3、经过本研究的前期研究发现，在病毒包膜中整合高亲和力anti-cd7 vhh与弱激活、低亲和力的anti-cd3 vhh，可有效提升慢病毒对静息态t细胞的感染效率。但后续深入研究发现，尽管anti-cd7/cd3 vhh靶向包膜结构可显著优化病毒递送效能，却易诱发t细胞耗竭。

4、因此，开发新的慢病毒包膜靶向结构从而有效防止或抑制t细胞耗竭对本领域具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明提供了基于pc5b识别基序的靶向融合蛋白及其应用。

2、在本发明的第一方面，提供了一种慢病毒包膜的靶向融合蛋白，所述融合蛋白从n端到c端包含：

3、(i) 抗原结合结构域，所述抗原结合结构域从n端到c端具有以下式i或式ii所示的结构：

4、vhh1-m-vhh2 (i)

5、vhh2-m-vhh1 (ii)

6、式中，

7、各“-”独立地为连接肽或肽键；

8、vhh1为抗cd3单域抗体；

9、vhh2为抗cd7单域抗体；

10、m为pc5b蛋白酶特异性识别切割基序；和

11、(ii) 跨膜结构域，所述跨膜结构域用于将所述融合蛋白锚定在病毒包膜上；

12、其中，所述抗cd3单域抗体的氨基酸序列如seq id no: 19所示；所述抗cd7单域抗体的氨基酸序列如seq id no: 13所示；

13、所述pc5b蛋白酶特异性识别切割基序从n端到c端的结构如式iii所示：

14、r-x1-x2-x3-z-r (iii)

15、式中，各字母分别独立地代表相应位置的氨基酸残基；r为精氨酸，z为精氨酸或赖氨酸；x1、x2和x3各自独立地为任意氨基酸残基。

16、在另一优选例中，所述抗原结合结构域与所述跨膜结构域之间还包含铰链区。

17、在另一优选例中，所述pc5b蛋白酶特异性识别切割基序的氨基酸序列如seq idno: 25、27、29和31中任一所示。

18、在另一优选例中，所述连接肽选自下组：whitlow/218 linker、g4s连接肽。

19、在另一优选例中，所述连接肽具有选自下组的氨基酸序列：gstsgsgkpgsgegstkg(seq id no: 15)、ggggs(seq id no: 17)。

20、在另一优选例中，所述融合蛋白具有如下式iv或式v所示的结构：

21、vhh1-m-vhh2-h-tm (iv)

22、vhh2-m-vhh1-h-tm (v)

23、式中，

24、各“-”独立地为连接肽或肽键；

25、vhh1为抗cd3单域抗体，所述抗cd3单域抗体的氨基酸序列如seq id no: 19所示；

26、vhh2为抗cd7单域抗体，所述抗cd7单域抗体的氨基酸序列如seq id no: 13所示；

27、m为pc5b蛋白酶特异性识别切割基序，所述pc5b蛋白酶特异性识别切割基序从n端到c端的结构如式iii所示：

28、r-x1-x2-x3-z-r (iii)

29、式中，各字母分别独立地代表相应位置的氨基酸残基；r为精氨酸，k为赖氨酸，z为精氨酸或赖氨酸；x1、x2和x3各自独立地为任意氨基酸残基；

30、h为铰链区，所述铰链区的氨基酸序列如seq id no: 21所示；

31、tm为跨膜结构域，所述跨膜结构域的氨基酸序列如seq id no: 23所示。

32、在另一优选例中，所述pc5b蛋白酶特异性识别切割基序的氨基酸序列如seq idno: 25、27、29和31中任一所示。

33、在另一优选例中，所述融合蛋白的抗原结合结构域的氨基酸序列如seq id no:37、40、43、46、49、52、55、58、61和64中任一所示。

34、在本发明的第二方面，提供了一种靶向t细胞的假型慢病毒载体，所述假型慢病毒载体的包膜上展示有本发明第一方面所述的融合蛋白。

35、在另一优选例中，所述假型慢病毒载体的包膜蛋白为改造的水疱性口炎病毒糖蛋白vsv-g mut。

36、在另一优选例中，所述vsv-g mut蛋白的氨基酸序列如seq id no: 9所示。

37、在另一优选例中，所述假型慢病毒载体还包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列。

38、在另一优选例中，所述嵌合抗原受体为同时靶向cd20和cd19的双靶向嵌合抗原受体，其氨基酸序列如seq id no: 1所示。

39、在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如seq id no: 2所示。

40、在本发明的第三方面，提供了一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的融合蛋白。

41、在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包含本发明第三方面所述的核酸分子。

42、在另一优选例中，所述表达载体为pmd2.g系列载体或其衍生物。

43、在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的表达载体、或基因组中整合有本发明第三方面所述的核酸分子、或表达本发明第一方面所述的融合蛋白。

44、在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：

45、(a) 本发明第二方面所述的假型慢病毒载体。

46、在另一优选例中，所述药物组合物还包含(b) 药学上可接受的载体。

47、在本发明的第七方面，提供了如本发明第二方面所述的假型慢病毒载体在制备用于治疗癌症或肿瘤的药物中的用途。

48、在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：实体瘤（如结肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌）、血液瘤（如淋巴瘤、多发性骨髓瘤）、或其组合。

49、在本发明的第八方面，提供了一种慢病毒包装系统，所述慢病毒包装系统包含：

50、(a) 一个或多个包装质粒，其包含编码慢病毒gag、pol和rev蛋白的核酸序列；

51、(b) 一个或多个表达质粒，其包含：

52、(i) 编码改造的水疱性口炎病毒糖蛋白vsv-g mut的核酸序列；

53、(ii) 编码本发明第一方面所述的融合蛋白的核酸序列；和

54、(iii) 可选地，编码嵌合抗原受体（car）的核酸序列。

55、在本发明的第九方面，提供了一种制备本发明第二方面所述假型慢病毒载体的方法，包括步骤：使用本发明第六方面所述的慢病毒包装系统转染宿主细胞。

56、在本发明的第十方面，提供了一种制备car-t细胞的方法，包括以下步骤：

57、(a) 提供t细胞；

58、(b) 用本发明第二方面所述的假型慢病毒载体感染所述t细胞；

59、其中，所述假型慢病毒载体还包含编码嵌合抗原受体（car）的核酸序列；

60、(c) 培养(b)中被感染的t细胞，获得car-t细胞。

61、在另一优选例中，步骤(a)中所述t细胞为静息t细胞（restingtcells），并且在感染前不进行额外的激活处理。

62、在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗性的。

63、在另一优选例中，所述方法是体外方法。

64、在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no: 1所示。

65、在另一优选例中，所述编码嵌合抗原受体的核酸序列如seq id no: 2所示。

66、在本发明的第十一方面，提供了一种car-t细胞，由本发明第八方面所述的方法制备得到。

67、在本发明的第十二方面，提供了本发明第十一方面所述的car-t细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

68、在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：实体瘤（如结肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌）、血液瘤（如淋巴瘤、多发性骨髓瘤）、或其组合。

69、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。