一种野鼠来源肺和/或肾类器官模型的构建方法及其在病毒感染研究中的应用

本技术涉及生物医学工程，具体涉及一种野鼠来源肺和/或肾类器官模型的构建方法及其在病毒感染研究中的应用。

背景技术：

1、汉坦病毒是一类重要的人兽共患病病原体，可在全球范围内引起肾综合征出血热等严重疾病。其中，汉滩病毒感染后可累及肺、肾、血管内皮及免疫系统，肺和肾是其重要靶器官。因此，建立能够反映肺、肾组织中病毒感染、复制、组织损伤及宿主应答特征的研究模型，对于阐明汉坦病毒感染机制、宿主适应性及防控策略具有重要意义。

2、目前，汉坦病毒相关研究主要依赖二维细胞系模型、整体动物模型及部分原代细胞模型。常用二维细胞系包括vero e6、a549、huvec及部分肾源细胞系等。该类模型培养简便、重复性较好，但细胞组成相对单一，缺乏三维空间结构和组织微环境，难以真实反映天然宿主靶器官中的细胞异质性及病毒感染过程。整体动物模型能够在一定程度上模拟体内感染过程，但存在实验周期长、成本高、个体差异大、操作复杂以及生物安全要求较高等问题。原代细胞模型虽然更接近来源组织状态，但通常存在样本获取困难、体外存活时间短、扩增能力有限和批次稳定性不足等缺陷。

3、野鼠是多种汉坦病毒的天然宿主或重要储存宿主。不同野鼠宿主在病毒易感性、复制支持能力、组织嗜性、免疫应答和耐受性等方面可能存在差异，这些差异与汉坦病毒的宿主适应、跨宿主传播及致病机制密切相关。因此，利用野鼠来源的肺、肾组织构建体外研究模型，有助于更接近天然宿主状态地研究汉坦病毒与宿主靶器官之间的相互作用。

4、类器官是一种三维体外培养体系，能够在特定基质和培养因子条件下，由组织干/祖细胞或组织来源细胞形成具有一定组织结构、细胞谱系和功能特征的微组织模型。与二维细胞模型相比，类器官能够更好地保留来源组织的部分结构和细胞组成；与整体动物模型相比，类器官具有体外操作可控、重复性较好、便于感染处理和多指标检测等优势。已有研究报道了人源或实验动物来源的肺类器官、肾类器官及其在疾病建模、药物筛选和感染研究中的应用。

5、然而，现有技术中，类器官模型主要集中于人源、实验小鼠或其他标准实验动物来源样本，针对野鼠来源肺和肾组织的类器官构建体系仍不完善。尤其是，现有技术缺乏以多种野鼠宿主来源肺、肾组织为基础，能够稳定形成三维结构并用于汉坦病毒感染研究的体外模型。对于黑线姬鼠、大足鼠和社鼠等与汉坦病毒传播和储存相关的野鼠宿主，尚缺乏可用于肺、肾靶器官感染评价的类器官培养体系。

6、因此，现有技术至少存在以下不足：第一，缺乏适用于野鼠来源肺和/或肾组织的类器官构建方法；第二，缺乏能够覆盖多种野鼠宿主来源样本的稳定三维培养体系；第三，缺乏能够用于评价汉坦病毒在野鼠肺、肾靶器官中感染、复制及细胞定位特征的体外模型；第四，现有二维细胞模型和整体动物模型难以同时满足组织真实性、宿主相关性、实验可控性和重复性的要求。

7、基于此，亟需建立一种来源于野鼠肺和/或肾组织的类器官模型，尤其是适用于黑线姬鼠、大足鼠和社鼠等野鼠宿主的肺类器官和肾类器官培养体系，并进一步用于汉坦病毒感染、病毒核酸检测、病毒滴度测定、免疫荧光检测及多重免疫荧光共定位分析，从而为汉坦病毒天然宿主靶器官感染机制研究提供新的体外技术平台。

技术实现思路

1、有鉴于此，本技术的目的在于提供一种野鼠来源肺和/或肾类器官模型的构建方法及其在病毒感染研究中的应用。本技术以野鼠肺组织和/或肾组织为起始材料，通过组织分离、消化、细胞或组织片段富集、基质包埋及类器官培养液诱导培养，构建具有三维结构特征的野鼠源肺类器官和/或肾类器官，并将其用于汉坦病毒的体外感染研究。本技术构建的类器官能够维持一定的组织来源特征和三维空间结构，保留天然宿主相关的细胞组成，兼具组织特异性与宿主特异性，且具有体外操作可控、重复性好、便于多维度检测分析的优势，为汉坦病毒靶器官感染机制、组织嗜性及细胞嗜性分析、宿主-病毒相互作用及抗病毒干预评价提供了更接近体内状态的三维体外实验平台。

2、为达到上述目的，本技术提供了如下技术方案：

3、第一方面，本技术提供了一种野鼠源肺和/或肾类器官的构建方法，所述野鼠为黑线姬鼠（apodemus agrarius）、大足鼠（rattus nitidus）和/或海南社鼠（niviventerlotipes），所述构建方法包括以下步骤：

4、（1）获取野鼠的肺组织和/或肾组织，并对所述组织进行清洗、杂质去除和剪碎处理；

5、（2）采用组织消化液对剪碎后的肺组织和/或肾组织进行消化处理，获得适于三维培养的细胞团、组织片段或细胞组分；

6、（3）将所得细胞团、组织片段或细胞组分接种于适于类器官生长的三维基质中，并加入相应的肺类器官培养液或肾类器官培养液进行培养；

7、（4）在37 ℃、5% co2条件下维持培养，获得野鼠源肺类器官和/或肾类器官。

8、在某些优选的实施方式中，步骤（2）中所述消化处理的条件为：于37 ℃、100 rpm恒温振荡培养箱中消化20-40 min；消化完成后加入胎牛血清至终浓度10%以终止反应；将消化产物经100 μm细胞筛过滤，收集滤液；滤液经离心后，加入红细胞裂解液进行红细胞裂解处理。

9、在某些实施方式中，步骤（3）中，所述三维基质为基质胶，接种方式为将细胞沉淀与预冷基质胶混匀后，以30 μl/孔点滴至培养板中央形成半球状胶滴，于37 ℃孵育15-30min使胶滴凝固后再加入类器官完全培养基进行培养。

10、在某些实施方式中，步骤（1）中所述野鼠的物种鉴定通过提取组织核酸后对线粒体细胞色素b基因进行pcr扩增和测序比对实现。

11、在某些实施方式中，所述构建方法还包括类器官传代步骤：收集类器官后以300 g离心3 min，弃上清；加入tryple于37 ℃消化3 min至类器官碎解；加入等体积基础培养基终止消化；用pbs洗涤后计数，并将细胞密度调整至1000-2000个/μl；再次以基质胶包埋后点胶铺板培养。

12、在某些实施方式中，所述构建方法还包括类器官冻存与复苏步骤：所述冻存步骤为收集类器官后用pbs清洗，离心弃上清，加入fbs:dmso=9:1的冻存液，混匀后分装冻存管，置于程序降温盒中于-80 ℃降温24 h后转移至液氮中长期保存；所述复苏步骤为从液氮中取出冻存管于37 ℃快速水浴融化，离心去除冻存液，用基础培养基洗涤2次后与预冷基质胶混匀铺胶培养。

13、第二方面，本技术提供了一种野鼠源肺和/或肾类器官，其由第一方面所述构建方法获得。所述类器官具有三维形态和组织样结构特征，明场成像显示所述类器官可形成球形、囊泡样或团块状三维结构，组织学染色显示所述类器官具有组织样结构。

14、第三方面，本技术提供了第二方面所述野鼠源肺和/或肾类器官在制备用于病毒感染研究的模型中的应用，其中所述类器官用于评价病毒在野鼠来源肺和/或肾组织样结构中的感染、复制、释放和/或细胞定位特征。

15、在某些优选的实施方式中，所述病毒为汉坦病毒，所述类器官用于如下至少一种检测分析：

16、（1）汉坦病毒感染和体外持续感染研究；

17、（2）汉坦病毒复制动力学研究；

18、（3）感染性病毒释放检测；

19、（4）病毒组织嗜性和细胞嗜性分析；

20、（5）宿主-病毒相互作用研究；

21、（6）宿主先天免疫及炎症反应研究；

22、（7）候选抗病毒药物、抗体、疫苗或其他干预策略的体外评价；

23、（8）不同野鼠宿主来源类器官与不同病毒株之间相互作用规律的比较研究。

24、在某些优选的实施方式中，所述汉坦病毒为htnv-2391株或大别山病毒（dbsv）。

25、第四方面，本技术提供了一种评价汉坦病毒在野鼠源肺和/或肾类器官中感染特征的方法，包括以下步骤：

26、（1）提供第二方面所述的野鼠源肺和/或肾类器官，所述野鼠源肺和/或肾类器官来源于黑线姬鼠、大足鼠和/或海南社鼠的肺组织和/或肾组织；

27、（2）将汉坦病毒接种于所述类器官，在体外培养条件下维持感染；

28、（3）对感染后的类器官进行检测分析，所述检测分析包括病毒核酸检测、病毒滴度测定、免疫荧光检测、整体免疫荧光染色和/或多重免疫荧光共定位检测中的至少一种检测手段；

29、通过上述步骤评价汉坦病毒在不同野鼠宿主来源和/或不同器官来源类器官中的感染、复制、释放及细胞定位特征差异。

30、与现有技术相比，本技术至少具备以下有益效果：

31、1.本技术首次建立了来源于野鼠天然宿主靶器官的三维类器官体外培养体系。本技术以野鼠肺组织和/或肾组织为起始材料，通过组织分离、消化、细胞或组织片段富集及基质包埋培养，成功构建了具有三维结构特征的野鼠源肺类器官和肾类器官，所得类器官可形成球形、囊泡样或团块状三维结构，经h&e染色显示具有清晰的组织样结构，且可稳定传代和冻存复苏。该模型直接来源于汉坦病毒天然宿主靶器官，相较于常规异源细胞系或二维细胞模型，能够更好地保留天然宿主相关的细胞组成和组织生物学特征，提高了病毒感染研究的宿主相关性。

32、2.本技术构建的类器官模型兼具组织特异性和宿主特异性。一方面，本技术分别构建了肺类器官和肾类器官，可用于比较汉坦病毒在不同靶器官来源模型中的感染差异，有助于分析病毒的组织嗜性及靶器官反应；另一方面，本技术适用于黑线姬鼠、大足鼠、社鼠等不同野鼠来源样本，可用于比较不同宿主背景下类器官对汉坦病毒感染的支持能力、病毒复制水平及宿主应答差异。同时，本技术构建的类器官在三维基质中形成空间结构，细胞之间能够建立更接近组织状态的相互作用关系，与二维贴壁细胞模型相比，在细胞排列、局部微环境及组织结构特征方面更接近来源组织状态。此外，与整体动物感染模型相比，本技术的类器官可在体外进行标准化培养和感染处理，便于对病毒接种量、感染时间、取样时间点及检测指标进行精确控制，实验周期短、成本低、重复性好。

33、3.本技术构建的野鼠源肺和/或肾类器官能够有效支持病毒感染、复制、释放及细胞定位分析。病毒感染实验结果表明，htnv-2391感染社鼠和大足鼠来源肺类器官及肾类器官后，12-168小时内各模型培养上清中均可检测到持续存在的病毒rna信号，并可检测到感染性子代病毒颗粒的释放，滴度维持在约2 log10 ffu/ml水平；dbsv感染社鼠来源类器官后亦可检测到病毒核酸动态变化，表明本技术构建的类器官可支持不同病毒的感染、复制及子代病毒释放过程。整体免疫荧光检测可在类器官三维结构中清晰地观察到病毒np抗原的空间分布；多重免疫荧光共定位分析进一步显示，肾类器官中htnv np信号与肾小管上皮细胞标志物cdh-1及增殖标志物ki-67存在空间关联，提示该模型可用于病毒组织嗜性、细胞嗜性及感染细胞类型分析。因此，本技术构建的类器官可作为体外三维病毒感染模型，用于评价病毒感染能力、复制动力学、感染性病毒释放、病毒抗原空间分布、组织嗜性、细胞嗜性、宿主-病毒相互作用、先天免疫及炎症反应、抗病毒药物筛选与评价、疫苗或抗体保护效果评价，以及不同野鼠宿主与不同病毒株之间相互作用规律的比较研究。

34、综上，本技术通过将野鼠来源肺和肾组织、三维类器官培养体系以及汉坦病毒感染评价相结合，构建了兼具天然宿主相关性、靶器官相关性、体外可控性和实验实用性的三维体外研究平台。该技术方案能够弥补现有二维细胞模型在组织微环境和细胞异质性模拟方面的不足，以及整体动物模型在实验便利性、周期和成本方面的局限，为汉坦病毒感染机制研究及相关药物、疫苗评价提供了新的体外模型体系。