用于合成抗转铁蛋白受体抗体缀合物的改进接头和方法与流程

本公开内容涉及用于将基于寡核苷酸的试剂(例如，rnai试剂)缀合至抗体或抗体片段(例如，抗转铁蛋白受体(tfr1)抗体或片段)的改进接头。序列表本技术含有序列表(符合标准st26)，其已以xml格式提交并且在此通过引用以其整体并入。xml序列表文件命名为30745-wo_seqlisting.xml，于2025年1月22日创建，且大小为990 kb。

背景技术：

1、在医学领域，在体内将治疗性有效负载引导至受试者的感兴趣的特定组织和细胞仍然是巨大的挑战。对于基于寡核苷酸的治疗剂尤其如此，所述基于寡核苷酸的治疗剂例如反义寡核苷酸(aso)和rna干扰(rnai)剂(典型地包含小(或短)干扰rna，其采用化学修饰的核苷酸)，其已显示巨大前景和潜力以革新医学领域以及对于过去无药可及的疾病提供有效的治疗性治疗选择；当然，条件是治疗寡核苷酸在体内可以到达期望的细胞和组织。事实上，获得基于寡核苷酸的治疗剂的合适递送仍然是克服发现和识别可行的治疗剂的最紧迫的挑战。

2、几种其他干扰rna递送方法正在对于体内用途进行测试/开发。例如，sirna可以以如下方式进行递送：在盐水溶液中“裸露的”；与多聚阳离子、阳离子脂质/脂质转染试剂、或阳离子肽复合；作为限定分子缀合物(例如，胆固醇修饰的sirna、tat-drbd/sirna复合物)的组分；作为脂质体的组分；以及作为纳米颗粒的组分。这些方法已显示了不同程度的成功。另一种方法是将sirna与抗体或抗体片段缀合。然而，仍然需要用于将sirna和其他基于寡核苷酸的试剂与抗体和抗体片段缀合的新的且改进的方法和接头，以提供rnai分子的靶向体内递送，其可以增强rnai的治疗潜力。

技术实现思路

1、本文提供了用于将基于寡核苷酸的试剂(例如，rnai试剂)缀合至抗体或抗体片段(例如，抗转铁蛋白受体(tfr1)抗体或片段)的新颖接头。

2、在一些方面，在此提供了式(i)的化合物：

3、 (i)，

4、或其药学上可接受的盐，其中：

5、fab为抗体或抗体片段；

6、r1为–or1a、–c(o)nhr1a、或–nhc(o)r1a，其中r1a为取代或未取代的c1-c6烷基、或取代或未取代的芳基；

7、z为二价或三价芳基基团、或二价或三价杂芳基基团；

8、y为取代或未取代的亚芳基、或取代或未取代的亚杂芳基；

9、y1的每个情形独立地为取代或未取代的亚芳基、或取代或未取代的亚杂芳基；

10、z1为不存在、二价或三价芳基基团、二价或三价杂芳基基团、分支的烷基链、或分支的杂烷基链；

11、l1为不存在或包含peg链的接头；

12、l2为不存在或接头；

13、r2包含基于寡核苷酸的试剂；

14、m为0或1；和

15、在化学价允许的情况下n为0或1。

16、在另一方面，本文提供了化合物，其包含抗体或抗体片段；和选自以下的结构：

17、，和

18、，或其药学上可接受的盐，其中：

19、l2为不存在或接头，

20、r2包含基于寡核苷酸的试剂，和

21、表示与所述抗体或抗体片段的附接点。

22、在某些实施方案中，本文提供的化合物具有下式：

23、，其中l2为不存在或接头，r2包含基于寡核苷酸的试剂，和表示与所述抗体或抗体片段的附接点。

24、在某些实施方案中，本文提供的化合物具有下式：

25、，其中r2包含基于寡核苷酸的试剂，和表示与所述抗体或抗体片段的附接点。

26、在某些实施方案中，本文提供的化合物具有下式：

27、，其中l2为不存在或接头，r2包含基于寡核苷酸的试剂，和表示与所述抗体或抗体片段的附接点。

28、在某些实施方案中，本文提供的化合物具有下式：

29、，其中r2包含基于寡核苷酸的试剂，和表示与所述抗体或抗体片段的附接点。

30、在一些方面，本文提供了式(ii)的化合物：

31、(ii)，

32、或其药学上可接受的盐，其中z1为不存在、二价或三价芳基基团、二价或三价杂芳基基团、分支的烷基链、或分支的杂烷基链；l1为不存在或包含peg链的接头；l2为不存在或接头；r2包含基于寡核苷酸的试剂；p为0或1；和x为离去基团。

33、在另一方面，本文提供了式(iii)的化合物：

34、(iii)，

35、或其药学上可接受的盐，其中z1为不存在、二价或三价芳基基团、二价或三价杂芳基基团、分支的烷基链、或分支的杂烷基链；l1为不存在或包含peg链的接头；l2为不存在或接头；r3为反应性部分；p为0或1；和x为离去基团。

36、在某些实施方案中，本文提供了下式的化合物：

37、、，或其药学上可接受的盐，其中l2为不存在或接头，r2包含基于寡核苷酸的试剂，和x为离去基团。

38、在某些实施方案中，本文提供了下式的化合物：

39、 (l-1026-p)、或

40、 (l20-p)、或其盐。

41、在一些方面，本文还提供了合成式(i)的化合物或其药学上可接受的盐的方法：

42、 (i)，

43、其中fab为抗体或抗体片段；r1为–or1a、–c(o)nhr1a、或–nhc(o)r1a，其中r1a为取代或未取代的c1-c6烷基、或取代或未取代的芳基；z为二价或三价芳基基团、或二价或三价杂芳基基团；y为取代或未取代的亚芳基、或取代或未取代的亚杂芳基；y1的每个情形独立地为取代或未取代的亚芳基、或取代或未取代的亚杂芳基；z1为不存在、二价或三价芳基基团、二价或三价杂芳基基团、分支的烷基链、或分支的杂烷基链；l1为不存在或包含peg链的接头；l2为不存在或接头；r2包含基于寡核苷酸的试剂；m为0或1；和在化学价允许的情况下n为0或1；其中所述方法包括使式(ii)的化合物或其药学上可接受的盐与包含半胱氨酸残基的抗体反应：

44、(ii)，

45、其中z1为不存在、二价或三价芳基基团、二价或三价杂芳基基团、分支的烷基链、或分支的杂烷基链；l1为不存在或包含peg链的接头；l2为不存在或接头；r2包含基于寡核苷酸的试剂；p为0或1；和x为离去基团。

46、定义

47、为方便起见，本文、说明书、实施例和权利要求中使用的某些术语收集在本文中。下述定义和说明意欲且预期在任何未来解释方面是控制性的，除非在下述实施例中是明确且无歧义地修改的，或者当含义的应用致使任何解释无意义或基本无意义时。在其中术语的解释致使其无意义或基本无意义的情况下，定义应该取自webster's dictionary，第三版，或本领域技术人员已知的词典，例如oxford dictionary of biochemistry andmolecular biology (编辑anthony smith, oxford university press, oxford, 2004)。

48、如本文使用的，除非另有说明，否则所有百分比均为按重量计的百分比。

49、如本文使用的且除非另有说明，否则术语“一个”和“一种”被视为意指“一个/种”、“至少一个/种”或“一个或多个/一种或多种”。除非上下文另有要求，否则本文使用的单数术语应该包括复数，并且复数术语应该包括单数。

50、如本文使用的，术语“受体”预期涵盖整个受体或其配体结合部分。受体的这些部分特别包括足以发生配体的特异性结合的那些区域，包括能够被抗体或抗体片段识别的那些区域。

51、抗体(可互换地以复数形式使用)是免疫球蛋白分子，其能够通过定位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点，与靶例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等特异性结合。如本文使用的，术语“抗体”，例如抗tfr1抗体，不仅涵盖了完整的(例如，全长)多克隆或单克隆抗体，还涵盖了其抗原结合片段(例如fab、fab'、f(ab')2、fv)、单链抗体(scfv)、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、单结构域抗体(例如，纳米抗体)、单结构域抗体(例如，仅vh抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型，其包含所需特异性的抗原识别位点，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。

52、抗体，例如抗tfr1抗体，包括任何类别的抗体，例如igd、ige、igg、iga或igm(或其亚类)，并且抗体无需属于任何特定类别。取决于其重链的恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配至不同类别。存在免疫球蛋白的五个主要类别：iga、igd、ige、igg和igm，并且这些中的几个可以进一步分成亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。与不同类别的免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

53、如本文使用的，术语“fab”指与tfr1抗原结合的抗原结合片段(fab)区，并且包括6个互补决定区(cdr)，其中3个cdr在可变轻链(vl)上，并且3个cdr在可变重链(vh)上。

54、术语“配体”定义为与受体分子结合，例如与蛋白质、核苷酸、或者其片段、结合结构域或互补体结合的任何分子或原子。

55、如本文使用的，术语“蛋白质”包括肽、多肽、共有分子、融合蛋白、纯化的天然存在的蛋白质、人工合成的蛋白质、重组蛋白质、抗体、抗体片段及其类似物、衍生物或组合。

56、术语“抗原结合片段”(例如，fab)进一步预期涵盖了包含来自多于一个物种的各部分的完全人源化和嵌合的抗体片段，双功能抗体片段等。

57、本文使用的术语“抗体”可指抗原结合片段区(fab)或包括抗体的fc部分的抗体，这取决于上下文。tfr1抗体的实例在本文中进行了描述。

58、术语“缀合物”定义为由两个或更多个分子组成；或者由偶联在一起的两个或更多个实体组成。优选地，两个分子或实体通过非特异性或特异性蛋白质-蛋白质相互作用、共价键合、非共价键合或配位化学键合进行缀合。在本发明的上下文中，第一分子可以是干扰rna分子(即rnai试剂)，而第二分子可以是如本文定义的靶细胞上的受体的配体。在一些实施方案中，术语缀合物包括与基于寡核苷酸的试剂(例如sirna)偶联的tfr1 fab，所述试剂还可以包括接头和/或肽或蛋白质，用于如本文所述的从内体中释放基于寡核苷酸的试剂。

59、如本文使用的，术语“干扰rna”和“干扰rna分子”指可以与risc相互作用，并参与risc介导的基因表达变化的所有rna或rna样分子。

60、除非另有说明，否则如本文使用的术语“sirna”指双链干扰rna。

61、如本文使用的，术语“治疗有效量”指确定为在哺乳动物中产生治疗应答的干扰rna或含有干扰rna的药物组合物的量。通过本领域普通技术人员并且使用如本文所述的方法容易地确定此类治疗有效量。

62、如本文使用的，提及基因或mrna的短语“减弱表达”意指施用或表达一定量的干扰rna (例如，sirna)，以通过mrna切割或通过翻译的直接抑制而降低靶mrna翻译成蛋白质。

63、如本文使用的，术语“抑制”、“沉默”和“减弱”指与不存在本发明的干扰rna的情况下靶mrna或相应蛋白质的表达相比，可测量的靶mrna或相应蛋白质的表达降低。

64、术语“敲低”指靶mrna或相应蛋白质的表达降低。

65、如本文使用的，短语“靶序列”和“靶mrna”指这样的mrna或mrna序列的一部分，其可以被本发明的方法中使用的干扰rna识别，由此所述干扰rna可以如本文所述沉默基因表达。

66、如本文使用的，“保守性氨基酸取代”指不改变氨基酸取代在其中进行的蛋白质的相对电荷或尺寸特性的氨基酸取代。可以根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法来制备变体，所述方法例如汇编此类方法的参考文献中发现的方法，例如molecular cloning：a laboratory manual，j. sambrook，等人，编辑，第二版，coldspring harbor laboratory press，cold spring harbor，new york，1989，或currentprotocols in molecular biology，f.m. ausubel，等人，编辑，john wiley&sons，inc.，new york。氨基酸的保守取代包括在下述组内的氨基酸中进行的取代：(a) m、i、l、v；(b)f、y、w；(c) k、r、h；(d) a、g；(e)s、t；(f) q、n；以及(g) e、d。

67、两个氨基酸序列的“同一性百分比”使用karlin和altschul proc. natl. acad.sci. usa 87：2264-68，1990的算法来确定，所述算法如karlin和altschul proc. natl.acad. sci. usa 90：5873-77，1993中进行修改。此类算法并入altschul，等人j. mol.biol. 215：403-10，1990的nblast和xblast程序(2.0版本)内。blast蛋白质搜索可以用xblast程序，评分=50，字长=3来执行，以获得与感兴趣的蛋白质分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在空位时，可以如altschul等人，

nucleic acids res. 25 (17)：3389-3402，1997中所述的，利用gapped blast。当利用blast和gapped blast程序时，可以使用各自程序(例如，xblast和nblast)的默认参数。

68、如本文使用的，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”是指连接的核苷的聚合物，每个核苷可以独立地修饰或未修饰。

69、如本文使用的，“rnai试剂”(也称为“rnai触发剂”)是指含有rna或rna样(例如，化学修饰的rna)寡核苷酸分子的组合物，所述寡核苷酸分子能够以序列特异性方式降解或抑制(例如，在适当条件下降解或抑制)靶信使rna (mrna)的mrna转录物的翻译。如本文使用的，rnai试剂可以通过rna干扰机制(即，通过与哺乳动物细胞的rna干扰途径机制(rna诱导的沉默复合物或risc)相互作用而诱导rna干扰)或通过任何一种或多种替代机制或途径起作用。尽管据信，rnai试剂(如该术语在本文所用的)主要通过rna干扰机制起作用，所公开的rnai试剂不受任何特定途径或作用机制的束缚或限制。本文公开的rnai试剂包含有义链和反义链，并且包括但不限于：短(或小)干扰rna (sirna)、双链rna (dsrna)、微rna(mirna)、短发夹rna (shrna)和dicer底物。本文所述的rnai试剂的反义链至少部分地与被靶向的mrna互补。rnai试剂可以包括一种或多种修饰的核苷酸和/或一种或多种非磷酸二酯键。

70、如本文使用的，术语“沉默”、“降低”、“抑制”、“下调”或“敲低”在涉及给定基因的表达时，是指与尚未如此处理的第二细胞、细胞组、组织、器官或受试者相比，当用本文所述的rnai试剂处理其中转录所述基因的细胞、细胞组、组织、器官或受试者时，所述细胞、细胞组、组织、器官或受试者中的所述基因表达降低，如通过由所述基因转录的rna水平或由mrna翻译的多肽、蛋白质或蛋白质亚基水平所测量。

71、如本文使用的，术语“序列”和“核苷酸序列”是指一连串或一系列核碱基或核苷酸，用标准命名法的一连串字母描述。

72、如本文使用的，“碱基”、“核苷酸碱基”或“核碱基”是杂环嘧啶或嘌呤化合物，其是核苷酸的组分，并且包括主要的嘌呤碱基腺嘌呤和鸟嘌呤，以及主要的嘧啶碱基胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核碱基可以进一步被修饰，以包括但不限于通用碱基、疏水碱基、混杂碱基、尺寸扩大的碱基和氟化碱基。(参见例如modified nucleosides in biochemistry,biotechnology and medicine, herdewijn, p.编辑. wiley-vch, 2008)。这样的修饰的核碱基(包括包括修饰的核碱基的亚磷酰胺化合物)的合成是本领域已知的。

73、如本文使用的，术语“核苷酸”具有本领域通常理解的相同含义，因此是指包含糖部分、碱基部分和共价连接基团(连接基团)例如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷间连接基团的糖苷，并涵盖天然存在的核苷酸例如dna或rna，以及非天然存在的核苷酸，其包含修饰的糖和/或碱基部分，在本文中也称为核苷酸类似物或修饰的核苷酸。在本文中，单个核苷酸可称为单体或单元。

74、如本文使用的，并且除非另有说明，否则术语“互补”当用于相对于第二核碱基或核苷酸序列(例如，rnai试剂反义链或单链反义寡核苷酸)描述第一核碱基或核苷酸序列(例如，rnai试剂有义链或靶向mrna)时，是指包括第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包括第二核苷酸序列的寡核苷酸在某些标准条件下杂交(在哺乳动物生理条件(或以其他方式合适的体内或体外条件)下形成碱基对氢键)并形成双链体或双螺旋结构的能力。

75、本领域普通技术人员会能够选择最适合杂交测试的条件组。互补序列包括沃森-克里克碱基对或非沃森-克里克碱基对，并且包括天然或修饰的核苷酸或核苷酸模拟物，至少在满足上述杂交要求的程度上。序列同一性或互补性不依赖于修饰。例如，为了确定同一性或互补性，如本文定义的a和af与u (或t)互补并与a相同。

76、除非另有说明，否则如本文使用的符号是指任何一个基团或多个基团可以与其连接，这与本文所述的本发明的范围一致。

77、如本文使用的，术语“异构体”是指具有相同分子式但在其原子键合的性质或顺序或其原子的空间排列上不同的化合物。在其原子的空间排列上不同的异构体称为“立体异构体”。彼此不成镜像的立体异构体称为“非对映异构体”，并且为不重叠镜像的立体异构体称为“对映异构体”，或有时称为光学异构体。与四个不相同的取代基键合的碳原子称为“手性中心”。

78、如本文使用的，除非在结构中特别指明具有特定构象，否则对于其中存在不对称中心并因此产生对映异构体、非对映异构体或其他立体异构构型的每种结构，本文公开的每种结构旨在代表所有这样的可能的异构体，包括它们的光学纯形式和外消旋形式。例如，本文公开的结构旨在涵盖非对映异构体的混合物以及单一立体异构体。

79、如本文权利要求中所用，短语“由...组成”排除权利要求中未指明的任何要素、步骤或成分。当在本文的权利要求中使用时，短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制到指定的材料或步骤以及那些不实质上影响要求保护的发明的一个或多个基本和新颖特征的材料或步骤。

80、本领域普通技术人员将容易理解和领会，本文公开的化合物和组合物可以具有质子化或去质子化状态的某些原子(例如，n、o或s原子)，这取决于化合物或组合物所处的环境。因此，如本文使用的，本文公开的结构设想某些官能团(例如oh、sh或nh)可以被质子化或去质子化。如本领域普通技术人员将容易理解的，本文的公开内容旨在涵盖所公开的化合物和组合物，而不管它们基于环境(例如ph)的质子化状态。相应地，本文所述的具有不稳定质子或碱性原子的化合物也应理解为表示相应化合物的盐形式。

81、本文所述的化合物可以呈游离酸、游离碱或盐形式。本文所述的化合物的药学上可接受的盐应理解为在本发明的范围内。

82、如本文使用的，术语“连接”或“缀合”在涉及两个化合物或分子之间的连接时是指两个化合物或分子通过共价键连接。除非说明，否则如本文使用的术语“连接”和“缀合”可以指具有或不具有任何插入的原子或原子团的第一化合物和第二化合物之间的连接。

83、如本文使用的，术语“包括”在本文中用于表示短语“包括但不限于”并且与之可互换使用。除非上下文另外明确指出，否则术语“或”在本文中用于表示术语“和/或”并且与之可互换使用。

84、除非另有定义，否则如本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，在下文描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用以其整体并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不旨在限制。

85、当明确记载数值时，应理解与所记载的数值大致相同数量或量的数值也在本公开内容范围内。当公开组合时，该组合中各要素的每个子组合也被具体公开并在本公开内容范围内。反之，当不同要素或要素组被个别公开时，它们的组合也被公开。当公开内容的任何要素被公开为具有多个替代时，其中单独地或以与其他替代组合地排除各替代的该公开内容的实例也在此被公开；公开内容中的多于一个要素可以具有这种排除，并且具有这种排除的要素的所有组合也在此被公开。

86、由以下详细描述、附图以及由权利要求，本发明的其他目标、特征、方面和优点将显而易见。