DNA聚合酶突变体的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体来说属于酶领域，更具体来说属于聚合酶领域，本发明还属于基因测序领域，尤其涉及dna聚合酶突变体。

背景技术：

1、二代测序(ngs)是目前广泛使用的高通量测序技术，而聚合酶作为其原理反应的重要核心组分之一，深刻影响着测序通量、速率、质量等各方面性能，也因此被广泛关注和不断研究、进化。9°n聚合酶是一种已在分子生物学实验、诊断和检测领域及测序领域被成熟应用的聚合酶，它具有较高的稳定性，较快的反应速率和良好的保真度。但不同的应用场景和反应原理对聚合酶提出来不同的性能要求，在测序领域尤其如此，不同的测序原理下的差异化底物结构、不同类别检测信号和不同反应体系等导致聚合酶必须针对特定原理进行进化、改造，以适应产品性能的要求。

2、荧光发生-可逆末端终止(fluorogenic reversible termination，简称为fg-rt)测序是一类新的边合成边测序的技术方法，该方法原理使用的底物为5’-末端磷酸荧光标记的可逆终止核苷酸，与其它测序技术相比，虽然测序底物都在3’端采取了可逆终止子修饰，但在荧光基团的修饰位置上有显著差异，fg-rt测序的底物核苷酸利用了荧光发生原理，荧光发生基团是修饰在磷酸末端而非碱基之上，在聚合反应发生后，在体系中存在的磷酸酶作用下，荧光发生基团脱去磷酸，发出荧光，从而可被检测和判读。这样的底物结构使得fg-rt生成的dna无疤痕，是进一步提高测序质量和长度的基础。不同的核苷酸底物结构对聚合酶提出了新的要求，已有的聚合酶对该类新修饰的核苷酸底物聚合能力不足，因此提供能够有效识别利用该类底物的聚合酶对fg-rt测序的实现和优化至关重要。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明公开了一类dna聚合酶突变体，能够有效识别利用5’-末端磷酸荧光标记的可逆终止核苷酸，高效催化荧光发生-可逆末端终止测序反应的实现。

2、本发明的第一方面公开了dna聚合酶突变体，其特征在于，与9°n dna聚合酶氨基酸序列seq id no:1相比，所述dna聚合酶突变体具有至少3个氨基酸取代突变，所述至少3个氨基酸取代突变包括：至少2个选自功能等价于或位置等价于9°n dna聚合酶氨基酸序列seq id no:1第408，409，410，483，485，578，580位的取代突变，以及至少1个选自功能等价于或位置等价于9°n dna聚合酶氨基酸序列seq id no:1第464，468，473，476，477，480，484，489位的取代突变。

3、根据优选的实施方式，所述dna聚合酶突变体具有至少4个氨基酸取代突变，所述至少4个氨基酸取代突变包括：至少3个选自功能等价于或位置等价于9°n dna聚合酶氨基酸序列seq id no:1第408，409，410，483，485，578，580位的取代突变，以及至少1个选自功能等价于或位置等价于9°n dna聚合酶氨基酸序列seq id no:1第464，468，473，476，477，480，484，489位的取代突变。

4、根据优选的实施方式，所述dna聚合酶突变体具有至少5个氨基酸取代突变，所述至少5个氨基酸取代突变包括：功能等价于或位置等价于9°n dna聚合酶氨基酸序列seq idno:1第408，409位的突变，以及至少2个选自功能等价于或位置等价于9°n dna聚合酶氨基酸序列seq id no:1第410，483，485，578，580位的取代突变，以及至少1个选自功能等价于或位置等价于9°ndna聚合酶氨基酸序列seq id no:1第464，468，473，476，477，480，484，489位的取代突变。

5、根据前述任一项实施方式所述的dna聚合酶突变体，所述氨基酸取代突变是：第408位的突变为l408m/s/a，第409位的突变为y409s/a，第410位的突变为p410v，第483位的突变为q483a/s/i，第485位的突变为a485l/r/f，第578位的突变为e578r/n/k，第580位的突变为e580k/q/r；第464位的突变为k464l/w，第468位的突变为k468s/g/t，第473位的突变为p473l/v，第476位的突变为k476f/l，第477位的突变为k477l/v，第480位的突变为d480s/l/f，第484位的突变为r484y/f/h，第489位的突变为l489i/a。

6、根据优选的实施方式，所述dna聚合酶突变体具有的氨基酸取代突变是：l408s，l409s，p410v，k468s，d480l，a485f，e578r；或者，l408s，l409a，k464w，a485l，e580q；或者l408a，l409a，p410v，k468g，d480l，a485l，e580k；或者，l408s，l409a，k468s，d480f，a485l，e580r；或者，l408m，l409s，p410v，k468s，p473l，a485l，l489i，e578n，e580r；或者，l408s，l409a，k464l，a485r，e580k；或者，l408s，l409a，k468g，d480l，a485l，e580k；或者，l408a，l409s，k464l，a485f，e578k；或者，l408a，l409s，k468t，p473v，a485r，l489a，e578k；或者，l408m，l409a，p410v，k468g，p473l，a485r，e578n；或者，l408s，l409a，k476f，k477v，a485l，e578k；或者，l408s，l409a，p410v，k476l，k477v，a485l，e580k；或者，l408s，l409a，k476f，k477l，a485r，e580k；或者，l408a，l409a，p410v，q483a，r484f，a485l，e580q；或者，l408m，l409a，q483s，r484y，a485l，e580k；或者，l408s，l409a，q483i，r484h，a485l，e580k；或者，l408s，l409a，k476l，d480s，a485l，l489a，e578r；或者l408a，l409a，k468s，d480l，a485l，l489a，e580k；或者，l408a，l409a，p410v，k464w，p473v，k477v，a485f，l489a，e580k；或者，l408m，l409s，k468g，d480s，a485l，e578n，e580k。

7、根据优选的实施方式，所述的dna聚合酶突变体包括：

8、1)seq id no:2-21，23，25，26，28，30中任一项所示的氨基酸序列；或者

9、2)与seq id no:2-21，23，25，26，28，30中任一项所示的氨基酸序列有至少70％氨基酸序列一致性并且具有dna聚合酶活性的氨基酸序列。

10、根据前述任一项实施方式所述的dna聚合酶突变体，由于所述氨基酸取代突变，所述dna聚合酶突变体相对于seq id no:1所示的9°n dna聚合酶在催化结构为式(ⅰ)的核苷酸时具有增加的活性：

11、

12、其中，y为o或s，b为杂环碱基，n为0-6的整数；r选自叠氮甲基、氨基、烯丙基、取代的二硫烷基、取代的甲氧甲基、邻硝基苄基类、香豆素类、磷酸腈基乙基酯、三甲硅基、四氢吡喃醚基、叠氮基、烷基羟氨基、硫代磷酸酯基、丙二酰基、苄基、乙缩醛、硫代氨基甲酸酯或乙烯基；fluorogenic dye选自具有荧光切换性质的蒽类、吩恶嗪类、吖啶类、香豆素类，所述具有荧光切换性质的蒽类包括氧杂蒽-荧光素类、碳杂蒽-北京橙类、硅杂蒽、锗杂蒽、磷氧杂蒽或硫杂蒽中的一种或多种。

13、本发明的第二方面提供编码前述任一项实施方式所述dna聚合酶突变体的dna分子；或含有所述dna分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

14、本发明的第三方面提供前述任一项实施方式所述dna聚合酶突变体或前述实施方式所述dna分子或所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备dna聚合酶中的应用。

15、本发明的第四方面提供前述任一项实施方式所述dna聚合酶突变体或前述实施方式所述dna分子或所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在测序中的应用；或前述任一项实施方式所述dna聚合酶突变体或前述实施方式所述dna分子或所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备用于测序的产品中的应用。

16、本发明的第五方面提供一种组合物，其特征在于，包括：

17、(i)前述任一项实施方式所述的dna聚合酶突变体；和

18、(ii)缓冲剂。

19、根据优选的实施方式，所述组合物还包括结构为式(ⅰ)的核苷酸：

20、

21、其中，y为o或s，b为杂环碱基，n为0-6的整数；r选自叠氮甲基、氨基、烯丙基、取代的二硫烷基、取代的甲氧甲基、邻硝基苄基类、香豆素类、磷酸腈基乙基酯、三甲硅基、四氢吡喃醚基、叠氮基、烷基羟氨基、硫代磷酸酯基、丙二酰基、苄基、乙缩醛、硫代氨基甲酸酯或乙烯基；fluorogenic dye选自具有荧光切换性质的蒽类、吩恶嗪类、吖啶类、香豆素类，所述具有荧光切换性质的蒽类包括氧杂蒽-荧光素类、碳杂蒽-北京橙类、硅杂蒽、锗杂蒽、磷氧杂蒽或硫杂蒽中的一种或多种。

22、本发明提供的dna聚合酶突变体，能够满足fg-rt测序底物的特殊结构和测序性能的要求，其反应活性较高，有较低的副反应和错误率，应用于fg-rt测序能有效提高反应效率、缩短反应时间，并可提高测序整体读长和正确率。