与薄壳山核桃种仁重量相关的分子标记及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种与薄壳山核桃种仁重量相关的分子标记及其应用。

背景技术：

1、种仁重量是薄壳山核桃（carya illinoinensis）重要的产量与品质性状之一，直接影响坚果的饱满度、出仁率与商品等级，是决定薄壳山核桃经济价值的关键指标。种仁重量属于典型的数量性状，受多基因控制且受环境条件影响显著。

2、传统种仁重量的选择依赖坚果成熟后脱壳、称重等表型测定，需对树木进行多年、多点的观测，且周期长、成本高，难以满足产业对高产优良种质快速挖掘与利用的需求。分子标记辅助选择（mas）可在苗期依据基因型进行早期筛选，大幅缩短育种周期。

3、目前薄壳山核桃高产育种中仍缺少稳定、易检测、与种仁重量紧密连锁的dna分子标记。因此，开发可用于种仁重量早期鉴定的snp分子标记，对推动高产分子育种具有重要意义。

技术实现思路

1、为解决前述技术问题，本发明开发了一套与薄壳山核桃种仁重量相关的分子标记。具体为通过高通量测序技术开发出与薄壳山核桃种仁重量相关的snp分子标记，并在遗传群体和自然群体中予以验证，该标记可用于薄壳山核桃种仁重量的预测和鉴定，同时将其应用于分子标记辅助育种（mas）中能加快薄壳山核桃高产优良新品种的选育进程。

2、本发明首要目的在于确定用于种仁重量性状相关的分子标记，所述分子标记位于薄壳山核桃基因组上，具体snp信息如表1所示：

3、表1 snp位点信息

4、

5、所述分子标记的序列包括seq id no.1~seq id no.2中至少一个，所述seq idno.1的多态性位点对应于seq id no.1的第301位g>a突变，其中g/g为高种仁重量的基因型，g/a为低种仁重量的基因型；所述seq id no.2的多态性位点对应于seq id no.2的第301位t>c突变，其中t/t为高种仁重量的基因型，t/c为低种仁重量的基因型。

6、所述序列在基因组内为单拷贝序列，所述序列具体如下：

7、seq id no.1

8、ccactacatattatattatttgttatttatgcattacatttcgaaatactaaattacaatatatgaattacataatcagtgattaaatttccataccaaatagcaacttcaaagtgattggcctgaaagtgatcctgcaaaaaacaaaatggaatgaaaaaccaatcaacattctcatcaaaacattatagatctaacccagaatttcatagaaacatggttaagcgtatagatttattctctattttttctgtctagacacgtttgaatagaatacctatgtgggctgcagacatcttargatttatggttgagacttgcaacatgaactcatgaactcattaggatttatcattgatcatatgtgattttcaggactatcactactactgctatattacacatatcaaacatgaagtacttggttgatattccaaaaatcaacggctataatacagtcactaaatgcaccccattcacatctgatcactgcaaagcccttattaaaaaaataaacatgtttctcttgtcaaccactaatcatgtagaatgggaaaaaggaaaggaaatggcaaacttactcttgaacagaaagaacaaa

9、seq id no.2

10、gttaaggcaagaaggcaaagtgcatagttacattgaagagtttaggcaactacaaactcttgtgagagggtggtccaaggaggcccttgtgggcacgtttgtggatgggttgaagccttggatagccaaggaaattaagttgaagcaactctctaagattcaagaagctatgaggatggtggagatcctagaagagagcactgatatagagaaatgtcaatctaaggaaatggggagtgaggttactacacccttgcaaaccaatgttccttggaaaggcaaggaggaaagggggagtgcytctaaatctaagccacttgaagtgaagaagctttcaagagaagaggtccaagatagaataaaaaagggtctttgttttaagtgtggagaaaaatgaggcatagggcacaaatgtagatcgggacaagtgtacatgttgattgatgagagaagcgagaaagatgatgatggttattttgtggaatcctctagccaagagtacaaccaagaggagaccaaagtgaatacaaattatgatgaggccgagttgtcccttaataccttgatggggacccaaaaacatacctccatgagggtaatg

11、为实现上述分子标记的高效精准检测，本发明提供一套适配特异性引物组，所述引物组包含2对引物对，其中seq id no.3~seq id no.4用于检测分子标记snp1，seq idno.5~seq id no.6用于检测分子标记snp2。

12、seq id no.3

13、cctatgtgggctgcagacat

14、seq id no.4

15、agggctttgcagtgatcaga

16、seq id no.5

17、aaaggcaaggaggaaagggg

18、seq id no.6

19、ggacaactcggcctcatcat

20、上述引物可用于一代或二代测序使用。

21、本发明还提供一种用于检测上述分子标记的试剂盒，核心组成部分为上述特异性引物组，同时包含专用mix（含taq酶、dntp、反应缓冲液）、无菌水、标准品对照（标准基因型模板各1管，浓度均为50ng/μl）。

22、本发明还提供一种薄壳山核桃种仁重量遗传改良的方法，所述方法包括以下步骤：

23、1）确定薄壳山核桃资源群体中与薄壳山核桃种仁重量相关的分子标记位点的基因型，所述分子标记位点为前述snp位点。

24、2）根据所述分子标记的基因型以及育种目标做出相应的选择。

25、其中步骤1)包括以下步骤：

26、1.1)提取待测薄壳山核桃的基因组dna；

27、1.2)对待测薄壳山核桃的基因型进行检测；

28、1.3)基于检测结果，确定所述待测薄壳山核桃在参考基因组第12号染色体上snp1位点、第8号染色体上snp2位点的基因型；

29、其中步骤2）包括以下至少一个步骤：

30、2.1）在所述薄壳山核桃资源群体中淘汰薄壳山核桃snp1位点为g/a型的个体，以逐代提高该位点的g/g基因型频率，从而提高后代薄壳山核桃的种仁重量。

31、2.2）在所述薄壳山核桃资源群体中淘汰薄壳山核桃snp2位点为t/c型的个体，以逐代提高该位点的t/t基因型频率，从而提高后代薄壳山核桃的种仁重量。

32、优选地，步骤2.1）中保留薄壳山核桃snp1位点为g/g型的个体，以逐代固定该位点的高种仁重量基因型频率，从而提高后代薄壳山核桃的种仁重量。

33、优选地，为了更加精准的进行遗传育种，其中步骤2）包括以下步骤：在薄壳山核桃资源群体中保留snp1和snp2组合基因型为g/g_t/t和/或（g/g_t/c、g/a_t/t）的个体，从而提高后代薄壳山核桃的种仁重量。

34、优选地，为了更加精准的进行遗传育种，其中步骤2）如下：在薄壳山核桃资源群体中保留薄壳山核桃第12号染色体上snp1、第8号染色体上snp2组合基因型为g/g_t/t的个体，从而提高后代薄壳山核桃的种仁重量。

35、本发明进一步提供一种评估薄壳山核桃种仁重量的方法，所述方法包括以下步骤：

36、1）确定薄壳山核桃资源群体中与薄壳山核桃种仁重量相关的分子标记位点的基因型，所述分子标记位点为前述snp位点。

37、2）根据所述分子标记的基因型判断薄壳山核桃样品的种仁重量。

38、其中步骤1)包括以下步骤：

39、1.1)提取待测薄壳山核桃的基因组dna；

40、1.2)对待测薄壳山核桃的基因型进行检测；

41、1.3)基于检测结果，确定所述待测薄壳山核桃在参考基因组第12号染色体上snp1位点、第8号染色体上snp2位点的基因型；其中步骤2）根据所述分子标记的基因型判断薄壳山核桃样品的种仁重量至少包括以下任一步骤：

42、2.1）在所述薄壳山核桃群体中，若所述薄壳山核桃样品在snp1位点的基因型为g/g型，则判定该样品为高种仁重量的样品。

43、2.2）在所述薄壳山核桃群体中，若所述薄壳山核桃样品在snp2位点的基因型为t/t型，则判定该样品为高种仁重量的样品。

44、优选地，为了更加精准的进行种仁重量评估，其中步骤2）包括以下步骤：在所述薄壳山核桃群体中，若所述薄壳山核桃样品在snp1和snp2位点的组合基因型为g/g_t/t和/或g/g_t/c和/或g/a_t/t，则判定该样品为高种仁重量的样品。

45、优选地，为了更加精准的进行种仁重量评估，其中步骤2）如下：在薄壳山核桃群体中，若所述薄壳山核桃样品在snp1和snp2位点的组合基因型为g/g_t/t，则判定该样品为高种仁重量的样品。

46、本发明的有益效果为：本发明的snp分子标记在薄壳山核桃种仁重量相关育种或预测薄壳山核桃种仁重量中具有重要应用价值，将其应用于分子标记辅助育种（mas）中，可实现苗期精准选种，淘汰低种仁重量（非目标）基因型个体，降低表型鉴定成本、缩短高产育种周期；所述分子标记为基于全基因组测序开发的snp标记，检测稳定、易于高通量规模化应用，且各标记位于基因组单拷贝区域，为薄壳山核桃高种仁重量种质资源评价与高产优良新品种选育提供有效的分子工具。同时，本发明的引物组或试剂盒在薄壳山核桃种仁重量相关育种或预测薄壳山核桃种仁重量中同样具备显著应用优势，其特异性强、检测结果稳定。