一种miRNA及其应用

本发明属于害虫防治，具体涉及一种mirna及其应用。

背景技术：

1、棉铃虫（

helicoverpa armigera）隶属于鳞翅目（lepidoptera）夜蛾科（noctuidae），原产于非洲南部，现已扩散至亚洲、非洲、欧洲、大洋洲及美洲等地区，成为世界范围内棉花、玉米、小麦、番茄、烟草等数十种作物的重要害虫。该虫具有寄主范围极广、迁飞扩散能力强、世代繁殖周期短、环境适应性高等生物学特性，且对多种化学农药已产生不同程度的抗药性，给全球农业生产造成巨大的经济损失，被联合国粮农组织（fao）列为世界性重大农业害虫之一。

2、害虫的防治策略主要包括农业防治、物理防治、生物防治和化学防治四大类。（1）农业防治：通过合理的栽培管理措施降低虫口基数，如轮作倒茬、间作套种、人工摘除卵块及捕杀幼虫等。近年来，推拉策略作为一种生态调控手段受到关注，即通过在田间种植具有驱避作用的作物以“推”离害虫，同时在周边种植具有引诱作用的作物以“拉”集害虫，从而干扰其寄主定位行为。然而，上述措施劳动强度大、效率低，难以满足规模化农业生产的需求。（2）物理防治：利用糖醋酒液、黄板及频振式杀虫灯等对成虫进行诱杀。但此类方法存在明显的生态副作用，诱虫装置在捕杀害虫的同时会大量误杀天敌昆虫和中性昆虫，破坏农田生态平衡；此外，设备的安装、维护及清理成本较高，且仅对成虫有效，无法防控幼虫期的危害。（3）生物防治：利用天敌昆虫（如赤眼蜂、草蛉）、病原微生物（如苏云金芽孢杆菌 bt）或昆虫病毒等进行防控。但该策略受限于天敌昆虫规模化饲养技术不成熟、生产成本高、田间释放操作复杂、防治效果不稳定等因素，在实际推广应用中面临较大困难。（4）化学防治：使用有机磷类、拟除虫菊酯类及双酰胺类等化学杀虫剂进行防控，因见效快、操作简便，仍是当前应用最广泛的手段。然而，长期过量使用化学农药已导致棉铃虫对多种药剂产生了严重的抗药性，同时引发了农药残留、环境污染、非靶标生物毒害及食品安全等一系列严峻问题。

3、开发高效专一、环境友好的新型害虫防控技术已成为农业可持续发展的迫切需求。rna干扰（rna interference，rnai）技术通过序列特异性地降解靶标mrna或抑制其翻译，实现对害虫关键基因的沉默，具有高度的靶标特异性和环境安全性。植物源mirna可通过摄食进入昆虫体内，在昆虫细胞中发挥基因调控功能，影响其生长发育、免疫应答及代谢解毒等关键生理过程，甚至导致害虫死亡。利用内源性植物mirna进行害虫防治具有来源天然、公众接受度高、易于通过转基因作物稳定表达等优势。因此，开展安全高效的抗虫植物源mirna的筛选与鉴定，将有助于绿色防治策略的推广应用。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供ghr-mir167a和ghr-mir396a相关生物材料在害虫防治和/或制备害虫防治产品中的应用。

2、本发明第二方面的目的，在于提供一种产品。

3、本发明第三方面的目的，在于提供一种防治害虫的方法。

4、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：

5、本发明的第一个方面，提供如下（1）-（6）所示物质中任一种在害虫防治和/或制备害虫防治的产品中的应用；

6、（1）ghr-mir167a或ghr-mir396a；

7、（2）ghr-mir167a或ghr-mir396a的前体；

8、（3）ghr-mir167a mimics或ghr-mir396a mimics；

9、（4）编码（1）中所述ghr-mir167a或ghr-mir396a的dna分子；

10、（5）编码（2）中所述ghr-mir167a或ghr-mir396a的前体的dna分子；

11、（6）含有（4）或（5）中所述dna分子的表达盒、重组载体或转基因细胞。

12、在本发明的一些实施方式中，所述ghr-mir167a或ghr-mir396a的核苷酸序列依次如seq id no:2-3所示。

13、在本发明的一些实施方式中，所述ghr-mir167a或ghr-mir396a包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其保留完整ghr-mir167a或ghr-mir396a核酸分子的相同功能，可通过核苷酸残基的缺失、置换或插入而发生突变。

14、本领域技术人员公知，为保证mirna的稳定性，可在mirna的一端或两端增加保护性碱基（如tt），可对mirna碱基进行修饰而不影响其功能。因此，在不影响ghr-mir167a或ghr-mir396a功能的条件下，对其进行的碱基修饰或在两端增加碱基所获得的序列同样包含在本发明的保护范围内，即所述ghr-mir167a或ghr-mir396a可以是序列中任意一个或多个核糖核苷酸被修饰的形式。

15、在本发明的一些实施方式中，所述ghr-mir167a或ghr-mir396a为成熟的mirna、前体mirna或初级转录物。

16、在本发明的一些实施方式中，所述ghr-mir167a或ghr-mir396a的核酸分子可以单链或双链形式存在，成熟的ghr-mir167a或ghr-mir396a主要呈单链形式，而前体部分自互补，可形成双链结构。所述ghr-mir167a或ghr-mir396a的核酸分子可以是rna、dna、pna或lna的形式。

17、在本发明的一些实施方式中，所述害虫包括鳞翅目昆虫。

18、在本发明的一些实施方式中，所述害虫为棉铃虫。

19、在本发明的一些实施方式中，所述害虫为幼虫期的害虫。

20、在本发明的一些实施方式中，所述产品为杀虫剂或杀昆虫药物。

21、在本发明的一些实施方式中，所述产品可制备成常规剂型使用，例如干粉、可湿性粉剂、乳油、微乳剂、糊剂、颗粒剂或悬浮剂。

22、在本发明的一些实施方式中，所述物质通过抑制害虫进食、抑制害虫生长发育和/或杀灭害虫实现害虫防治。

23、在本发明的一些实施方式中，所述物质通过延缓害虫生长，使其无法完成变态发育，进而导致死亡。

24、由于ghr-mir167a或ghr-mir396a来源于陆地棉，对人类安全，可作为安全有效的棉铃虫新型杀虫剂，可直接使用或用于构建转基因植物。因此，过表达ghr-mir167a或ghr-mir396a的转基因植物在棉铃虫防治中也具有实际应用价值。

25、本发明的第二个方面，提供一种产品，包括如下（1）-（6）所示物质中的任一种：

26、（1）ghr-mir167a或ghr-mir396a；

27、（2）ghr-mir167a或ghr-mir396a的前体；

28、（3）ghr-mir167a mimics或ghr-mir396a mimics；

29、（4）编码（1）中所述ghr-mir167a或ghr-mir396a的dna分子；

30、（5）编码（2）中所述ghr-mir167a或ghr-mir396a的前体的dna分子；

31、（6）含有（4）或（5）中所述dna分子的表达盒、重组载体或转基因细胞。

32、在本发明的一些实施方式中，所述ghr-mir167a或ghr-mir396a的核苷酸序列依次如seq id no:2-3所示。

33、在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂、药物或杀虫剂中的至少一种。

34、在本发明的一些实施方式中，所述产品还包括药学上可接受的载体，所述载体包括但不限于稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、矫味剂或吸附载体。

35、本发明的第三个方面，提供一种防治害虫的方法，包括将本发明第一方面中所述的物质或本发明第二方面的产品施用于害虫或害虫栖息地。

36、在本发明的一些实施方式中，所述方法包括将害虫、害虫的食物（如棉花、玉米、番茄、辣椒、小麦、高粱、大豆、花生等植物）、害虫的生境（害虫正在生长或可生长的土壤、区域、材料或环境，或欲保护以免受害虫攻击或侵染的材料、栽培植物、植物繁殖材料如种子、土壤表面）用所述物质或产品进行处理。例如，可通过构建表达ghr-mir167a和/或ghr-mir396a或其mimics、前体的转基因植物用于防治害虫；又如，可直接将ghr-mir167a和/或ghr-mir396a或其mimics、前体通过喷施或注射的方式导入害虫体内（如从棉铃虫虫体倒数第1腹节与第2腹节之间的侧腹部进行注射）。

37、在本发明的一些实施方式中，将有效剂量的本发明第一方面中所述的物质或本发明第二方面的产品施用于害虫或害虫栖息地。

38、一般而言，“有效量”意指实现可观察的杀虫效果所需的活性成分的量，所述可观察效果包括坏死、死亡、阻滞、预防、去除、破坏或减少靶标生物存在和活性等效果。对于本发明所用的ghr-mir167a或ghr-mir396a或其mimics而言，有效量可根据期望的杀虫效果和持续时间、气候条件、靶标种类、施用地点、施用模式等主要条件而变化。

39、在本发明的一些实施方式中，所述害虫包括鳞翅目昆虫。

40、在本发明的一些实施方式中，所述害虫为棉铃虫。

41、本发明的有益效果是：

42、本发明首次发现向害虫（如棉铃虫幼虫）注射陆地棉来源的ghr-mir167a或ghr-mir396a可显著降低其存活率和进食量，并抑制生长发育。低龄幼虫是害虫防治的有效期。上述研究结果证明上述mirna可用于防治棉铃虫幼虫，具备通过构建转基因植物（如棉花、玉米等）进行应用的潜力。

43、具体地：通过人工合成mimics并注射棉铃虫4龄幼虫，发现ghr-mir167a和ghr-mir396a均具有较强的抗虫效果。与对照组（depc水和nc mimics）相比，注射ghr-mir167a和ghr-mir396a的棉铃虫幼虫168 h存活率显著降低，总进食量明显减少，且生长趋势显著延缓。

44、为探究ghr-mir167a和ghr-mir396a导致棉铃虫死亡或生长抑制的分子机制，本发明在注射48 h后进行了整虫转录组测序分析。结果显示，与对照组相比，注射ghr-mir167amimics的幼虫中有277个基因显著下调，注射ghr-mir396a mimics的幼虫中有568个基因显著下调。kegg通路富集分析进一步发现，ghr-mir167a主要调控脂肪酸合成与代谢、ampk信号通路、ppar信号通路、蛋白质消化与吸收、氨基酸合成与代谢等通路；ghr-mir396a则主要影响糖类化合物代谢、脂肪酸合成与代谢、蛋白质消化与吸收及维生素消化与吸收等通路。这些通路均为昆虫维持正常生命活动所必需的营养代谢和能量代谢途径。

45、综上所述，ghr-mir167a和ghr-mir396a通过抑制棉铃虫广泛的生命活动相关基因群（涵盖能量代谢、蛋白质代谢、脂肪代谢及碳水化合物代谢等），干扰其正常的营养摄取、能量供应和生长发育，从而导致幼虫生长延缓甚至死亡。因此，ghr-mir167a和ghr-mir396a是良好的害虫防治分子，可通过转基因植物表达或外源施用的方式应用于棉铃虫的绿色防控。