土壤DNA提取试剂盒和提取方法与流程

本发明涉及分子生物学与环境样本前处理，尤其涉及一种土壤dna提取试剂盒和提取方法。

背景技术：

1、土壤样本dna提取的主要难点在于样本中同时存在腐殖酸、富里酸、多酚样有色小分子、蛋白质、胶体颗粒及矿物吸附位点等多重干扰因素。强裂解虽然有助于释放dna，但通常会同步溶出更多腐殖质和有色物，导致上清发黄、a260/a230偏低，并显著抑制后续上柱、磁珠结合及扩增反应。

2、现有商业土壤dna提取产品普遍采用机械裂解、去抑制和柱法或磁珠纯化的总体路线。传统酸性乙酸钾条件可形成不溶性十二烷基硫酸钾（kds）沉淀以去除sds，但过强或过量的kds网络容易夹带总dna；高聚铝盐（如pacl或pac（聚合氯化铝））可去除腐殖质，但在剂量、ph或接触时间不适宜时容易进入扫除絮凝区，诱发dna共沉。因此，本领域仍需要一种适用于“总dna保留于上清”的环境样本工艺，使裂解、sds去除、腐殖质去除和后续核酸纯化之间形成可控衔接。

3、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种土壤dna提取试剂盒及提取方法，通过钾盐沉淀液与聚合氯化铝沉淀液的序贯联动处理，使前一处理步骤去除残留sds、蛋白、细胞碎片和土壤颗粒，并形成适于后一处理步骤发挥选择性除杂作用的ph和离子环境；后一处理步骤采用低剂量、短接触方式去除残余腐殖质和有色杂质，从而兼顾dna保留和抑制物去除。

2、第一方面，本发明提供了一种土壤dna提取试剂盒，包括磷酸盐缓冲液、sds裂解液、钾盐沉淀液和聚合氯化铝沉淀液；所述sds裂解液包括3 wt%~6 wt% sds、10~50 mmtris-hcl、1 wt%~2 wt% pvp-40、5~10 mm焦亚硫酸钠，余量为水；所述钾盐沉淀液包括2~4m钾盐，余量为水，ph为6.0~7.0；所述聚合氯化铝沉淀液包括聚合氯化铝和水，以有效al2o3质量含量计，所述聚合氯化铝的浓度为0.005 wt%~0.03 wt%。

3、作为进一步技术方案，所述磷酸盐缓冲液包括50~100 mm混合磷酸盐、5~20 mmedta，余量为水，ph为7.8~8.2；所述混合磷酸盐由磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的至少一种磷酸二氢盐与至少一种磷酸氢盐组成。

4、作为进一步技术方案，所述钾盐包括乙酸钾。

5、作为进一步技术方案，述钾盐沉淀液与所述聚合氯化铝沉淀液以序贯方式用于纯化前处理；所述钾盐沉淀液用于去除裂解体系中的sds、蛋白、细胞碎片和土壤颗粒，并调节处理液的ph和离子环境；所述聚合氯化铝沉淀液用于对经所述钾盐沉淀液处理后的液相进行处理，以去除残余腐殖质和有色杂质。

6、作为进一步技术方案，还包括核酸结合液、洗涤液和洗脱液；所述核酸结合液、洗涤液和洗脱液用于对经所述钾盐沉淀液和/或所述聚合氯化铝沉淀液处理后的液相进行硅胶膜离心柱纯化或磁珠纯化。

7、作为进一步技术方案，还包括研磨珠。

8、作为进一步技术方案，按质量百分比计，所述研磨珠包括25%粒径为0.12 mm的研磨珠、25%粒径为0.2 mm的研磨珠、40%粒径为0.52 mm的研磨珠和10%粒径为3.2 mm的研磨珠。

9、第二方面，本发明提供了一种土壤dna的提取方法，采用上述试剂盒进行提取，包括以下步骤：将土壤样品与研磨珠、磷酸盐缓冲液和sds裂解液混合进行裂解，固液分离后收集第一清液；向第一清液中加入钾盐沉淀液进行沉淀处理，经固液分离后收集第二清液；根据第二清液的颜色或吸光特征选择性加入聚合氯化铝沉淀液进行处理，经固液分离后收集第三清液；将第二清液或第三清液进行核酸结合、洗涤和洗脱，获得土壤dna。

10、作为进一步技术方案，所述磷酸盐缓冲液和所述sds裂解液的体积比为4:1~6:1；所述钾盐沉淀液的加入量为第一清液体积的0.15~0.35倍，所述沉淀处理时间为30 s~3min。

11、作为进一步技术方案，所述聚合氯化铝沉淀液在第二清液呈黄色、棕黄色或a260/a230低于1.0时加入；所述聚合氯化铝沉淀液的加入量为第二清液体积的0.01~0.10倍，聚合氯化铝沉淀液处理的时间为15 s~2 min。

12、相较于现有技术，本发明具有如下有益效果：

13、本发明提供的试剂盒包括磷酸盐缓冲液、sds裂解液、钾盐沉淀液和聚合氯化铝沉淀液，并可选包括核酸结合液、洗涤液、洗脱液和研磨珠。其中，磷酸盐缓冲液与sds裂解液配合用于土壤样本裂解和dna释放；钾盐沉淀液与聚合氯化铝沉淀液构成序贯联动除杂体系，其中钾盐沉淀液用于去除残留sds、蛋白、细胞碎片和土壤颗粒，并形成适于聚合氯化铝短接触除杂的ph和离子环境；聚合氯化铝沉淀液用于去除残余腐殖质及有色杂质。该试剂盒通过裂解、联动除杂和纯化组分的配合，在保证dna回收率的同时降低腐殖质环境样本中dna与去污剂、蛋白和颜色体共沉的风险，提升了不同腐殖质含量土壤样本中高纯度核酸提取的适用性。

1. 一种土壤dna提取试剂盒，其特征在于，包括磷酸盐缓冲液、sds裂解液、钾盐沉淀液和聚合氯化铝沉淀液；所述sds裂解液包括3 wt%~6 wt% sds、10~50 mm tris-hcl、1 wt%~2wt% pvp-40、5~10 mm焦亚硫酸钠，余量为水；所述钾盐沉淀液包括2~4 m钾盐，余量为水，ph为6.0~7.0；所述聚合氯化铝沉淀液包括聚合氯化铝和水，以有效al2o3质量含量计，所述聚合氯化铝的浓度为0.005 wt%~0.03 wt%。

2. 根据权利要求1所述的土壤dna提取试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液包括50~100 mm混合磷酸盐、5~20 mm edta，余量为水，ph为7.8~8.2；所述混合磷酸盐由磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的至少一种磷酸二氢盐与至少一种磷酸氢盐组成。

3.根据权利要求1所述的土壤dna提取试剂盒，其特征在于，所述钾盐包括乙酸钾。

4.根据权利要求1所述的土壤dna提取试剂盒，其特征在于，述钾盐沉淀液与所述聚合氯化铝沉淀液以序贯方式用于纯化前处理；所述钾盐沉淀液用于去除裂解体系中的sds、蛋白、细胞碎片和土壤颗粒，并调节处理液的ph和离子环境；所述聚合氯化铝沉淀液用于对经所述钾盐沉淀液处理后的液相进行处理，以去除残余腐殖质和有色杂质。

5.根据权利要求1所述的土壤dna提取试剂盒，其特征在于，还包括核酸结合液、洗涤液和洗脱液；所述核酸结合液、洗涤液和洗脱液用于对经所述钾盐沉淀液和/或所述聚合氯化铝沉淀液处理后的液相进行硅胶膜离心柱纯化或磁珠纯化。

6.根据权利要求1所述的土壤dna提取试剂盒，其特征在于，还包括研磨珠。

7. 根据权利要求6所述的土壤dna提取试剂盒，其特征在于，按质量百分比计，所述研磨珠包括25%粒径为0.12 mm的研磨珠、25%粒径为0.2 mm的研磨珠、40%粒径为0.52 mm的研磨珠和10%粒径为3.2 mm的研磨珠。

8.一种土壤dna的提取方法，其特征在于，采用权利要求1~7任一项所述的试剂盒进行提取，包括以下步骤：将土壤样品与研磨珠、磷酸盐缓冲液和sds裂解液混合进行裂解，固液分离后收集第一清液；向第一清液中加入钾盐沉淀液进行沉淀处理，经固液分离后收集第二清液；根据第二清液的颜色或吸光特征选择性加入聚合氯化铝沉淀液进行处理，经固液分离后收集第三清液；将第二清液或第三清液进行核酸结合、洗涤和洗脱，获得土壤dna。

9. 根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液和所述sds裂解液的体积比为4:1~6:1；所述钾盐沉淀液的加入量为第一清液体积的0.15~0.35倍，所述沉淀处理的时间为30 s~3 min。

10. 根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述聚合氯化铝沉淀液在第二清液呈黄色、棕黄色或a260/a230低于1.0时加入；所述聚合氯化铝沉淀液的加入量为第二清液体积的0.01~0.10倍，聚合氯化铝沉淀液处理的时间为15 s~2 min。