蚕蛹肽及其制备方法和应用

本发明属于生物，涉及从蚕蛹获得的蚕蛹肽及其制备方法和应用。

背景技术：

1、肠道疾病是目前国内外高发的健康问题之一。不规律饮食、压力、药物使用等因素均可导致肠道菌群失调，表现为益生菌减少、条件致病菌增多，严重时可引发结肠炎、腹泻、便秘甚至全身性感染。目前，补充益生菌是缓解肠道紊乱、恢复肠道稳态的常见手段。罗伊氏粘液乳杆菌(limosilactobacillus reuteri)作为人体肠道中重要的共生菌，具有良好的胃肠环境耐受性、肠上皮黏附能力及广谱抗菌活性。其代谢产物罗伊氏菌素可抑制多种肠道病原菌，因此在调节肠道微生态平衡中具有重要意义。然而，益生菌在肠道中长期发挥作用的前提是能够高效增殖并维持代谢活性。乳酸菌由于自身缺乏完整的氨基酸生物合成途径，必须依赖外源性氮源来满足蛋白质合成及氮代谢需求，其生长与代谢高度依赖于环境中易吸收利用的氮源物质。

2、近年来，小分子活性肽因其易吸收利用及潜在生物活性，被认为是优质的氮源替代物。研究表明，分子量小于3 kda的肽更易被乳酸菌摄取，并能调控其代谢途径。此外，蛋白质类物质具有潜在的益生功能，能显著促进双歧杆菌(bifidobacterium)、鼠李糖乳酪杆菌(lacticaseibacillus rhamnosus)、植物乳植物杆菌(lactiplantibacillusplantarum)等益生菌的生长和代谢，从而起到调节肠道菌群的作用。蚕蛹作为我国传统的药食同源资源，干基蛋白质含量高达45%-60%，氨基酸组成均衡，是理想的肽源原料。其酶解所得的小分子蚕蛹肽已被报道具有抗氧化、抗炎及免疫调节等活性。然而，目前蚕蛹肽的制备多集中于提高水解度或获取抗氧化活性，尚缺乏针对益生菌生长调控的定向制备策略。

3、因此，开发能够定向酶解并富集特定分子量区间的蚕蛹肽及其制备方法，对于提高原料利用率、获得具有明确促益生菌功能的活性肽，具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于，提供一种能够显著促进粘液乳杆菌(limosilactobacillus)增殖、有机酸代谢并维持其形态完整性的蚕蛹肽，以解决现有技术缺乏对益生菌生长进行调控的蚕蛹肽的技术问题。

2、本发明的目的和技术问题可以通过以下技术方案来实现。

3、在第一方面，本发明提供了促进粘液乳杆菌增殖、有机酸代谢以及保护菌体形态完整性的蚕蛹肽，所述蚕蛹肽的分子量为1.0-3.0 kda，包含3-13个氨基酸残基，富含谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸残基，且所述蚕蛹肽是通过以下方法制备：

4、1) 原料预处理：将蚕蛹清洗、烘干、粉碎、过40-80目筛，得到蚕蛹粉；

5、2) 脱脂处理：将所述蚕蛹粉用有机溶剂进行脱脂处理，脱脂条件为：料液比1:10-1:15 (g/ml)，温度40-50℃，时间2-5小时，重复1-3次，然后离心、干燥，得到脱脂蚕蛹粉；

6、3) 酶解处理：将所述脱脂蚕蛹粉配制成质量分数10%-20%的水溶液，调节ph至碱性蛋白酶或风味蛋白酶的最适ph，加入质量为脱脂蚕蛹粉5%-7%的碱性蛋白酶或风味蛋白酶，酶解2.5-3.5小时；

7、4) 酶解结束后，使酶灭火，8000-10000 rpm离心10-20分钟，取上清液，冷冻干燥，得到蚕蛹肽粗品；

8、5) 膜分离纯化：将蚕蛹肽粗品的水溶液依次通过截留分子量为3 kda和1 kda的超滤膜，收集分子量在1-3 kda区间的组分，干燥后即得所述蚕蛹肽。

9、在第二方面，本发明提供了促进粘液乳杆菌增殖、有机酸代谢以及保护菌体形态完整性的组合物，该组合物第一方面所述的蚕蛹肽。

10、在第三方面，本发明提供了第一方面所述蚕蛹肽在以下方面中的应用：1) 促进粘液乳杆菌增殖；2) 提高粘液乳杆菌的乳酸和乙酸产量；3) 保护粘液乳杆菌的菌体形态完整性；以及4) 延缓粘液乳杆菌衰亡。

11、与现有技术相比，本发明具有显著进步。本发明以缫丝废弃物蚕蛹为原料通过酶解获得分子量为1-3 kda的蚕蛹肽。这些蚕蛹肽能够显著促进粘液乳杆菌增殖，高效促进粘液乳杆菌有机酸代谢，提高粘液乳杆菌的乳酸和乙酸产量，并能够保护粘液乳杆菌菌体形态完整性，延缓其衰亡。本发明由于以缫丝废弃物蚕蛹为原料极大地提高了蚕桑产业副产物的附加值，成本低廉，环境友好。

1.蚕蛹肽，其特征在于，所述蚕蛹肽的分子量为1.0-3.0 kda，包含3-13个氨基酸，富含谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸，且所述蚕蛹肽是通过包括以下步骤的方法制备：

2.根据权利要求1所述的蚕蛹肽，其特征在于，所述溶剂为油醚、正己烷、环己烷、石油醚-丙酮(3:7，v/v)或石油醚-乙醇(1:1-1:4)。

3.根据权利要求1所述的蚕蛹肽，其特征在于，所述溶剂为正己烷。

4.根据权利要求1所述的蚕蛹肽，其特征在于，所述蚕蛹肽的分子量为1-2 kda，且将所述分子量为1.0-3.0 kda的蚕蛹肽通过葡聚糖凝胶g-50进行层析，收集1-2 kda区间的洗脱组分而获得。

5.根据权利要求1所述的蚕蛹肽，其特征在于，所述蚕蛹肽包含seq id nos: 1-116中至少一条。

6.促进粘液乳杆菌(limosilactobacillus)增殖、有机酸代谢以及保护菌体形态完整性的组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的蚕蛹肽。

7.权利要求1所述蚕蛹肽在以下方面中的应用：

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述粘液乳杆菌为罗伊氏粘液乳杆菌(l.reuteri)。