一种基于磁场调控的miRNA量子检测方法

本发明涉及检测领域，尤其涉及一种基于磁场调控的mirna量子检测方法，一种基于磁场调控nv色心的mirna-21便携式量子检测方法。

背景技术：

1、mirna-21是多种恶性肿瘤（乳腺癌、肺癌、肝癌等）高度相关的微小rna肿瘤标志物，在肿瘤早期阶段患者体液内即出现表达上调；实现体液样本mirna-21的超灵敏快速检测，对肿瘤早期筛查、疗效动态监测具有重大临床意义。

2、侧向层析（lfa）试纸条具备操作简便、无需大型设备、适合基层床旁检测的优势；现有mirna侧向层析方案多采用胶体金、有机荧光染料、量子点作为信号标记物。胶体金仅适合高浓度样本肉眼判读；有机荧光染料、量子点存在光漂白缺陷；并且硝酸纤维素膜、血清样本基质会产生显著背景荧光；低丰度靶标时，有效信号淹没在背景荧光中，信噪比恶化，很难实现超低丰度检出。

3、带有氮空位色心的荧光纳米金刚石是一种固态量子荧光材料：532nm激发产生680nm红色荧光，抗光漂白，荧光稳定性极佳；nv色心自旋能级可以被外部磁场调控，发生塞曼分裂，进而造成荧光强度衰减；而nc膜、生物样本的本征背景荧光属于普通荧光，不受外磁场调制。

4、现有公开专利cn119104532a公开了液相体系下，羧化fnd经edc-nhs活化后共价偶联氨基修饰dna探针，用于低丰度mirna的量子检测，但该方案为液相磁珠富集体系，不能适配侧向层析床旁快速检测场景。

5、现有cn117106906a专利，在侧向层析试纸条中使用2.87ghz微波配合ω谐振器调控nv色心自旋；微波谐振器件体积大、功耗高，很难做成手持便携式设备；并且该方案需要全套定制侧向层析试纸叠层膜垫结构，耗材开发成本高，无法直接复用市面成熟侧向层析基底耗材。

6、因此，需要针对性开发新型的检测方法，克服上述问题。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术的不足与缺陷，本发明提供一种基于磁场调控的mirna量子检测方法，无需核酸扩增，试纸条可复用商用通用侧向层析基底耗材，无需定制全套膜-垫叠层结构；微型电磁铁模组体积小巧，可集成为手持整机，实现基层、床旁场景mirna-21超灵敏检测，为肿瘤早期筛查提供检测手段。

2、技术方案：本发明的一种基于磁场调控的mirna量子检测方法，其特征在于：采用便携式检测装置配合通用侧向层析试纸条完成mirna-21检测，包括下述步骤：

3、1）样本层析捕获：将待测体液样本与上样缓冲液混合后加载至通用侧向层析试纸条；待测mirna-21与fnd上的检测dna探针特异性杂交形成杂交复合体，复合体随层析液迁移并被测试线t捕获富集；测试线t富集fnd数量与样本mirna-21浓度正相关；

4、2）高浓度样本静态荧光检测：层析反应完成后，采用荧光激发收集装置输出532nm激发光照射测试线t，直接采集680nm波段静态荧光信号，实现mirna-21定性或半定量判定；

5、3）低丰度样本磁场差分定量检测：保持532nm激发光功率恒定，先采集未施加磁场条件下测试线t原始荧光信号f0；再通过微型电磁铁对测试线t区域施加可控外磁场，nv色心受塞曼效应发生荧光衰减，采集施加磁场后的荧光信号fb；计算差分信号δf=f0－fb；硝酸纤维素膜、样本基质产生的背景荧光不受外磁场调控，背景信号通过差分运算抵消；差分信号δf与测试线t富集的fnd数量线性相关，实现低丰度mirna-21定量检测。

6、优选的，还包括步骤4）质控校验：读取质控线c荧光信号，当质控线c检出荧光则判定层析流程有效；质控线c无荧光，则判定检测结果无效。优选地，布置微型电磁铁位置，使磁场主要集中覆盖测试线t，降低质控线c位置处磁场强度，尽量避免质控线上fnd荧光被磁场调制，保障质控判读可靠性。

7、优选的，所述的便携式检测装置包括荧光激发收集装置与微型电磁铁；所述通用侧向层析试纸条为市售侧向层析基底耗材，无需对样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫叠层结构做定制改造，仅在硝酸纤维素膜上设置测试线t与质控线c，测试线t喷涂mirna-21捕获探针，质控线c喷涂质控捕获探针，信号探针为含有氮空位nv色心的荧光纳米金刚石fnd；所述fnd的表面羧基经活化后，共价偶联氨基修饰的mirna-21检测dna探针；所述nv色心在532nm激发光下发射680nm红色荧光，并且nv色心荧光可被外磁场通过塞曼效应调制衰减。各模块能够集成封装为手持整机，配套耗材为喷涂捕获探针的通用侧向层析试纸条。

8、优选的，所述的荧光激发收集装置输出532nm激发光照射通用侧向层析试纸条的测试线区域；fnd富集在试纸测试线位置；微型电磁铁对准测试线局部施加可控外磁场；荧光激发收集装置采集fnd发射的680nm荧光。

9、优选的，所述的便携式检测装置设置有用于放置通用侧向层析试纸条的试纸条放置位，使试纸条测试线t处于光路与磁场作用中心。

10、优选的，所述的荧光激发收集装置为集成532nm微型激光器与微型光谱探测器的手持光学模组。

11、优选的，所述的荧光激发收集装置用于输出532nm激发光，并采集、输出测试线t处680nm波段的原始荧光信号f0、fb。

12、优选的，所述的fnd颗粒粒径为20nm-600nm；fnd表面羧基经edc-nhs活化，形成酰胺键共价连接氨基修饰的mirna-21检测dna探针。

13、优选的，所述的微型电磁铁为便携式电磁线圈模组，产生1mt-800mt局部磁场，磁场作用于测试线t区域。

14、优选的，所述的微型电磁铁设置于对应测试线t的位置，用于向测试线t输出可控局部磁场。

15、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：本发明复用通用侧向层析试纸条基底，不需要对试纸条膜-垫叠层结构做定制改造；fnd-nv探针采用羧基-氨基共价偶联氨基修饰dna检测探针；配套集成微型电磁铁与微型荧光激发收集单元的便携式检测整机；利用nv色心磁场塞曼效应做差分信号读出，从原理上消除nc膜与体液基质的背景荧光干扰；无需核酸扩增，兼顾高浓度静态判读、低丰度磁场差分定量两种模式，适合基层医疗机构、床旁快速肿瘤初筛场景。克服现有技术的mirna-21侧向层析检测背景干扰严重、低丰度灵敏度不足、现有nv调控设备体积庞大无法便携、试纸耗材需要全定制成本高的缺陷。

1.一种基于磁场调控的mirna量子检测方法，其特征在于：采用便携式检测装置配合通用侧向层析试纸条（2）完成mirna-21检测，包括下述步骤：

2.根据权利要求1所述的基于磁场调控的mirna量子检测方法，其特征在于：还包括步骤4）质控校验：读取质控线c荧光信号，当质控线c检出荧光则判定层析流程有效；质控线c无荧光，则判定检测结果无效。

3.根据权利要求1或2所述的基于磁场调控的mirna量子检测方法，其特征在于：所述的便携式检测装置包括荧光激发收集装置（1）与微型电磁铁（4）；所述通用侧向层析试纸条（2）为市售侧向层析基底耗材，无需对样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫叠层结构做定制改造，仅在硝酸纤维素膜上设置测试线t与质控线c，测试线t喷涂mirna-21捕获探针，质控线c喷涂质控捕获探针，信号探针为含有氮空位nv色心的荧光纳米金刚石fnd（3）；所述fnd（3）的表面羧基经活化后，共价偶联氨基修饰的mirna-21检测dna探针；所述nv色心在532nm激发光下发射680nm红色荧光，并且nv色心荧光可被外磁场通过塞曼效应调制衰减。

4.根据权利要求3所述的基于磁场调控的mirna量子检测方法，其特征在于：所述的荧光激发收集装置（1）输出532nm激发光照射通用侧向层析试纸条（2）的测试线区域；fnd（3）富集在试纸测试线位置；微型电磁铁（4）对准测试线局部施加可控外磁场；荧光激发收集装置（1）采集fnd发射的680nm荧光。

5.根据权利要求3所述的基于磁场调控的mirna量子检测方法，其特征在于：所述的便携式检测装置设置有用于放置通用侧向层析试纸条（2）的试纸条放置位，使试纸条测试线t处于光路与磁场作用中心。

6.根据权利要求3所述的基于磁场调控的mirna量子检测方法，其特征在于：所述的荧光激发收集装置（1）为集成532nm微型激光器与微型光谱探测器的手持光学模组。

7.根据权利要求6所述的基于磁场调控的mirna量子检测方法，其特征在于：所述的荧光激发收集装置（1）用于输出532nm激发光，并采集、输出测试线t处680nm波段的原始荧光信号f0、fb。

8.根据权利要求3所述的基于磁场调控的mirna量子检测方法，其特征在于：所述的fnd（3）颗粒粒径为20nm-600nm；fnd（3）表面羧基经edc-nhs活化，形成酰胺键共价连接氨基修饰的mirna-21检测dna探针。

9.根据权利要求3所述的基于磁场调控的mirna量子检测方法，其特征在于：所述的微型电磁铁（4）为便携式电磁线圈模组，产生1mt-800mt局部磁场，磁场作用于测试线t区域。

10.根据权利要求9所述的基于磁场调控的mirna量子检测方法，其特征在于：所述的微型电磁铁（4）设置于对应测试线t的位置，用于向测试线t输出可控局部磁场。