一种基于ERA-CRISPR/Cas14a检测结核分枝杆菌的sgRNA、试剂盒及方法

本发明属于结核分枝杆菌检测，尤其涉及基于era和crispr/cas14a组合检测结核分枝杆菌的sgrna、试剂盒及方法。

背景技术：

1、结核病（tuberculosis, tb）是由结核分枝杆菌（

mycobacterium tuberculosis,

m.tb）感染引起的人畜共患传染病。tb与hiv双重感染及耐药株的出现，使得开发一种快速、灵敏、特异且可视化的结核分枝杆菌的检测方法成为公共卫生领域的迫切需求。

2、目前，针对结核分枝杆菌的检测方法主要包括显微镜检查、细菌培养、免疫学检测及分子生物学检测等，具体如下：

3、抗酸杆菌（acid-fast bacilli, afb）涂片检查：该方法检查简单、价廉，但灵敏度低，易受菌载量的影响，尤其对菌量低患者漏检率高，对非结核分枝杆菌（ntm）缺乏良好的特异性，难以满足早期诊断要求；

4、分离培养：作为病原学诊断的“金标准”，可靠性和标准化程度高，但其生长缓慢，周期长达4-8周，难以实现快速检测；

5、免疫学检测：主要涉及脂阿拉伯甘露聚（lam）抗原检测、结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test, tst）、γ-干扰素释放试验（interferon gamma release assay,igra）及血清学检测等。lam检测为尿液检查，简单、快速、廉价，但灵敏度较低，仅适用于免疫功能严重受损的活动性结核患者。tst检测通过皮内注射结核菌素诱导机体免疫反应进行判定，但该方法无法区分自然感染、卡介苗接种（bcg）或ntm感染，特异性低，易出现假阴性。igra通过检测结核抗原刺激后t细胞释放的γ-干扰素水平进行判定，检测成本较高，对实验条件要求较高，限制了其在基层应用。血清学检测（如elisa/eia）主要检测机体针对结核分枝杆菌抗原产生的特异性抗体，检测结果受个体免疫状态影响大，稳定性和准确性存在一定局限；

6、分子生物学检测：该方法凭借高灵敏度和高特异性，已成为结核分枝杆菌检测的重要工具，主要包括：实时荧光定量pcr（qpcr）、环介导等温扩增（lamp）、全基因组测序（wgs）以及基于crispr-cas系统的核酸检测技术等。其中，pcr技术依赖昂贵的热循环仪和热稳定dna聚合酶，不适于现场检测；等温核酸扩增技术无需复杂仪器，可在恒温下快速扩增核酸；crispr-cas系统可实现高特异性核酸识别，但单独使用灵敏度有限，通常需要与核酸扩增技术结合。

7、综合来看，现有方法存在检测周期长、灵敏度和特异性不足或现场应用困难等问题，亟需开发快速、灵敏、特异性高的结核分枝杆菌检测方法。

技术实现思路

1、本发明实施例的目的在于提供基于era和crispr/cas14a组合检测结核分枝杆菌的sgrna、试剂盒及方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一方面，本发明提供了基于era和crispr/cas14a组合检测结核分枝杆菌的sgrna，所述sgrna的序列如seq id no.11所示。

4、另一方面，本发明提供了一种基于era和crispr/cas14a组合检测结核分枝杆菌的试剂盒，包括上述sgrna、cas14a蛋白、修饰有荧光基团和淬灭基团的单链dna报告分子、10×holmes buffer以及用于era扩增的上、下游引物。

5、另一方面，本发明提供了一种上述sgrna或上述试剂盒在非诊断目的的检测结核分枝杆菌中的应用。

6、另一方面，本发明提供了一种非诊断目的的基于era和crispr/cas14a组合检测结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

7、s1、利用上述试剂盒中的用于era扩增的上、下游引物进行era扩增获得crispr/cas14a检测核酸样本；

8、s2、将上述试剂盒中的除引物外的各组分与crispr/cas14a检测核酸样本混匀后，在37 ℃的条件下反应20 min；

9、s3、在反应过程中或反应结束时进行荧光强度检测，当荧光强度高于0 rfu或裸眼直接观察到荧光，则证明检测到结核分枝杆菌。

10、与现有技术相比，本发明的具体有益效果为：

11、1、灵敏度更高，本发明的检测限：2.07 cfu/ml（菌液）和3.51 copies/µl（基因组dna），通过针对靶序列设计并筛选的era引物，在era扩增过程中更高效地识别并结合模板，显著提升era扩增的灵敏度，并缩短era反应时间；

12、2、更加快速，检测时间仅需28分钟：era扩增技术为crispr检测提供了坚实基础，针对目标序列精心设计的sgrna能够最大限度地引导cas14a蛋白识别并结合目标序列，进而激活cas14a蛋白的反式切割活性以切割单链dna，显著提升了crispr检测的效率并缩短了检测时间；

13、3、降低成本：在era-crispr检测的整个流程中，靶序列的筛选、era引物和sgrna的设计尤为关键，本发明所筛选的靶序列以及设计的era和sgrna显著提升了era扩增的效率和crispr检测的准确性，在优化过程中，通过调整相关试剂的浓度和体积，进一步降低了检测成本。

1.基于era和crispr/cas14a组合检测结核分枝杆菌的sgrna，其特征在于，所述sgrna的序列如seq id no.11所示。

2.一种基于era和crispr/cas14a组合检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的sgrna、cas14a蛋白、修饰有荧光基团和淬灭基团的单链dna报告分子、10×holmes buffer以及用于era扩增的上、下游引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述用于era扩增的上、下游引物的序列如seq id no.7-8所示。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述cas14a蛋白选自un1cas12f1。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述修饰有荧光基团和淬灭基团的单链dna报告分子为5′-fam-tttttttt-bhq1-3′。

6.一种如权利要求1所述的sgrna或如权利要求2所述的试剂盒在非诊断目的的检测结核分枝杆菌中的应用。

7.一种非诊断目的的基于era和crispr/cas14a组合检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，s1中，所述era扩增的体系为：用于era扩增的上游引物1~20 μm，用于era扩增的下游引物1~20 μm，待检测样本dna模板5~25 μm、溶解剂da 20 μl、激活剂mc 2 μl、depc水补足至50 μl。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，s1中，所述era扩增的过程为：提取待检测样本dna模板后，按照era扩增的体系加入各组分并混匀后，在37 ℃反应8 min。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，s3中，所述荧光强度检测具体为：在450-520 nm波长光源照射下进行。