一种鉴别林荫鼠尾草的InDel分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及植物分子标记，具体涉及一种鉴别林荫鼠尾草的indel分子标记及其应用。

背景技术：

1、林荫鼠尾草（

salvia nemorosa）是唇形科鼠尾草属多年生草本植物，原产于欧洲中部和西亚地区，因其紫色的穗状花序和较长的花期，被广泛用作园林绿化植物和蜜源植物。林荫鼠尾草全株含有挥发油，具有抗菌、抗炎等药用价值，在中医药领域也有广泛应用。

2、鼠尾草属（

salvia）是唇形科中最大的属之一，全球约有900余种，中国约有80余种。由于鼠尾草属植物种类繁多，许多种类在形态上相似，尤其在营养生长期很难从形态上准确区分。传统的分类方法主要依据花、叶等形态特征，但存在主观性强、受环境影响大等缺点。林荫鼠尾草与近缘种如快乐鼠尾草（

salvia sclarea）、欧鼠尾草（

salvia

officinalis）、一串红（salvia splendens）、墨西哥鼠尾草（

salvia leucantha）等在幼苗期形态相似，容易造成混淆，给园林绿化种植、药用植物栽培和种质资源保护带来困难。

3、随着分子生物学技术的发展，dna分子标记技术为植物品种的准确鉴别提供了可靠手段。indel（insertion-deletion，插入缺失）标记是基于基因组中插入或缺失位点开发的共显性分子标记，具有多态性高、稳定性好、检测简便等优点，在植物品种鉴别、遗传多样性分析和分子育种中得到了广泛应用。叶绿体基因组具有母系遗传、进化速率适中、序列保守等特点，是开发种间鉴别分子标记的理想材料。

4、目前，针对林荫鼠尾草的特异性分子标记研究较少，缺乏能够快速、准确鉴别林荫鼠尾草与其他鼠尾草品种的分子标记。因此，开发林荫鼠尾草特异性的indel分子标记，建立快速准确的分子鉴别方法，对于保护林荫鼠尾草种质资源、防止品种混淆、指导园林绿化应用和药用植物栽培具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种鉴别林荫鼠尾草的indel分子标记及其应用。本发明的indel分子标记能够将林荫鼠尾草与其他鼠尾草属品种有效区分，为林荫鼠尾草苗木早期品种鉴别、种质资源保护和分子辅助育种提供一种简单、快速和有效的辅助方法。

2、为实现上述目的，本发明所设计的技术方案如下：

3、本发明提供了一种鉴别林荫鼠尾草的indel分子标记，所述indel分子标记的核苷酸序列如seq id no：1所示。

4、本发明还提供了一种所述的indel分子标记在林荫鼠尾草苗期品种鉴别、种质资源保护或分子辅助育种中的应用。

5、本发明还提供了一种用于获得所述的indel分子标记的引物对，所述引物对为：

6、indel-1f：5'-aaagtaggttttttcgttatgggcc-3'；

7、indel-1r：5'-tgaaatcttgcttggtcttcactg-3'。

8、进一步地，所述引物对扩增得到的序列为245 bp的条带时，该条带含有所述的indel分子标记indel-1，则待测鼠尾草属植物为林荫鼠尾草；所述条带的核苷酸序列如seqid no：4所示。

9、本发明还提供了一种所述的引物对在林荫鼠尾草苗期品种鉴别、种质资源保护或分子辅助育种中的应用。

10、本发明还提供了一种鉴别林荫鼠尾草的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。

11、本发明还提供了一种利用所述的试剂盒鉴别林荫鼠尾草的方法，包括以下步骤：

12、（1）提取待测鼠尾草属植物的基因组dna；

13、（2）以提取的基因组dna为模板，使用试剂盒中的引物对indel-1f和indel-1r对其进行pcr扩增；

14、（3）对pcr产物进行sanger测序，当pcr产物为245 bp的条带时，该条带含有indel分子标记indel-1，则待测鼠尾草属植物为林荫鼠尾草。

15、进一步地，所述条带的核苷酸序列如seq id no：4所示。

16、本发明还提供了一种利用所述的试剂盒鉴别林荫鼠尾草的方法，包括以下步骤：

17、①提取待测鼠尾草属植物的基因组dna；

18、②使用lightcycler® high resolution melting master和试剂盒中的引物对，对待测鼠尾草属植物的基因组dna进行实时荧光定量pcr扩增；

19、③对实时荧光定量pcr产物进行hrm分析，当待测鼠尾草属植物的最高熔解峰在76.5℃，则待测鼠尾草属植物为林荫鼠尾草。

20、本发明还提供了一种所述的试剂盒在林荫鼠尾草苗期品种鉴别、种质资源保护或分子辅助育种中的应用。

21、本发明的有益效果：

22、（1）特异性强：本发明的indel分子标记位于林荫鼠尾草叶绿体基因组的特异位点，能够将林荫鼠尾草与快乐鼠尾草、欧鼠尾草、一串红、墨西哥鼠尾草等常见易混鼠尾草种有效区分，鉴别结果直观、可靠；

23、（2）稳定性好：叶绿体基因组具有母系遗传、序列保守、拷贝数多等特点，基于叶绿体indel位点的分子标记不受核基因组杂合性、栽培环境和生长阶段的影响，鉴别结果稳定；

24、（3）可用于苗期早期鉴别：本发明可在种苗营养生长阶段或幼苗期取少量叶片即可完成鉴别，无需等待开花期，大幅缩短品种鉴别周期，降低苗木错种、混种造成的经济损失；

25、（4）应用范围广：本发明的indel分子标记及其引物对可开发为特异性检测试剂盒，广泛应用于园林绿化种苗质量控制、种质资源库鉴别、药用植物栽培原料真伪辨别以及分子辅助育种等领域。

1.一种鉴别林荫鼠尾草的indel分子标记，其特征在于：所述indel分子标记的核苷酸序列如seq id no：1所示。

2.一种权利要求1所述的indel分子标记在林荫鼠尾草苗期品种鉴别、种质资源保护或分子辅助育种中的应用。

3.一种用于获得权利要求1所述的indel分子标记的引物对，其特征在于：所述引物对为：

4.根据权利要求3所述的引物对，其特征在于：所述引物对扩增得到的序列为245 bp的条带时，该条带含有所述的indel分子标记indel-1，则待测鼠尾草属植物为林荫鼠尾草；所述条带的核苷酸序列如seq id no：4所示。

5.一种权利要求3所述的引物对在林荫鼠尾草苗期品种鉴别、种质资源保护或分子辅助育种中的应用。

6.一种鉴别林荫鼠尾草的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求3所述的引物对。

7.一种利用权利要求6所述的试剂盒鉴别林荫鼠尾草的方法，其特征在于：包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述条带的核苷酸序列如seq id no：4所示。

9.一种利用权利要求6所述的试剂盒鉴别林荫鼠尾草的方法，其特征在于：包括以下步骤：

10.一种权利要求6所述的试剂盒在林荫鼠尾草苗期品种鉴别、种质资源保护或分子辅助育种中的应用。