缺氧耐受性CAR-T细胞及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种缺氧耐受性car-t细胞及其制备方法与应用。

背景技术：

1、car-t细胞疗法是一种革命性的肿瘤免疫治疗方法，通过基因工程技术改造患者自身的t细胞，使其能够特异性识别并攻击肿瘤细胞。这种方法最早由以色列科学家提出，并在近年来取得了显著进展。car-t细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中，如急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤等，已经展现了卓越的治疗效果，部分患者甚至实现了完全缓解。其通过增强t细胞的靶向性、杀伤性和持久性，为癌症治疗开辟了新的途径。随着研究的深入，car-t细胞疗法在实体瘤治疗中的潜力也逐渐被挖掘。

2、尽管car-t细胞疗法在肿瘤治疗中取得了显著成效，但在实体瘤治疗中，尤其是面对缺氧环境时，仍面临诸多技术缺陷。实体瘤内部通常存在低氧区域，这种缺氧环境会削弱car-t细胞的增殖能力和杀死癌细胞的能力。同时，缺氧还会诱导肿瘤细胞产生免疫抑制因子，进一步抑制car-t细胞的功能。这些技术缺陷限制了car-t细胞在实体瘤治疗中的广泛应用。

3、因此，本领域迫切需要一种在缺氧环境或实体瘤中具有优异治疗效果的car-t细胞。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种在缺氧环境或实体瘤中具有优异治疗效果的car-t细胞及其制备方法和应用。

2、本发明的第一方面，提供了一种工程化的car-t细胞，所述工程化的car-t细胞中，内源的pim3蛋白的表达和/或功能被下调。

3、在另一优选例中，所述car-t细胞具有选自下组的一种或多种特征：

4、(a)增加记忆表型；

5、(b)提高长效杀伤能力；

6、(c)提高分泌细胞因子的水平。

7、在另一优选例中，所述细胞因子选自下组：ifn-γ、tnf-α、颗粒酶b、或其组合。

8、在另一优选例中，所述car-t细胞还具有选自下组的一种或多种特征：

9、(d)降低效应表型；

10、(e)降低在缺氧环境中的凋亡率；

11、(f)上调cd107a的表达。

12、在另一优选例中，所述下调指基因不表达所编码的蛋白、低表达所编码的蛋白、发生失活突变或所编码的蛋白发生活性下降的突变；其中，所述“低表达”指所述免疫细胞中所述蛋白的表达量g1与相同类型的正常免疫细胞中所述蛋白的表达量g0的比值不高于0.5，即g1/g0≤0.5，较佳地g1/g0≤0.3，更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，最佳地为0。

13、在另一优选例中，所述car-t细胞包含用于降低pim3基因表达和/或pim3蛋白功能的基因调控系统。

14、在另一优选例中，在所述car-t细胞中，内源的pim3基因被破坏。

15、在另一优选例中，所述car-t细胞包括单个细胞或多个细胞构成的细胞群。

16、在另一优选例中，所述免疫细胞发生pim3基因的失活突变，所述失活突变包括在所述基因序列中缺失、取代或插入一个或多个核苷酸。

17、在另一优选例中，所述的pim3蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。

18、在另一优选例中，所述基因调控系统包含sirna、shrna、微小rna(mirna)、抑制性mrna、或dsrna。

19、在另一优选例中，工程化的car-t细胞的肿瘤杀伤能力(p1)与car-t细胞的肿瘤杀伤能力(p0)相比，两者比例(p1/p0)≥1.1，较佳地≥1.2，更佳地≥1.3。

20、本发明第二方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述的工程化car-t细胞的方法，包括步骤：

21、(s1)提供一待改造的car-t细胞；和

22、(s2)通过基因工程改造，使所述的免疫细胞中，内源的pim3蛋白的表达和/或功能被下调，从而获得如本发明第一方面所述的car-t细胞。

23、在另一优选例中，所述步骤(s2)通过一种或多种crispr/cas介导的基因编辑系统进行。

24、本发明第三方面，提供了一种用于制备如本发明第一方面所述的car-t细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：

25、(i)第一容器，以及位于第一容器的核酸序列，所述核酸序列含有用于下调pim3基因的表达盒或靶向pim3基因的grna；和

26、(ii)第二容器，以及位于第二容器的car-t细胞。

27、在另一优选例中，在第二容器中，所述car-t细胞的pim3蛋白的表达和/或功能未被下调。

28、在另一优选例中，所述表达盒位于载体。

29、在另一优选例中，所述的载体为病毒载体。

30、在另一优选例中，所述的载体选自下组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

31、在另一优选例中，所述的反义rna包括mirna、sirna、shrna、抑制性mrna、或dsrna。

32、在另一优选例中，所述试剂盒还包含说明书，所述说明书记载了以下方法：

33、(s1)提供一待改造的car-t细胞；和

34、(s2)通过基因工程改造，使所述的免疫细胞中，内源的pim3蛋白的表达和/或功能被下调，从而获得如本发明第一方面所述的car-t细胞。

35、本发明第四方面，提供了一种制剂，所述制剂含有如本发明第一方面所述的工程化的car-t细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

36、在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

37、在另一优选例中，所述制剂为注射剂。

38、在另一优选例中，所述制剂中所述工程化的car-t细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×103-1×107个细胞/ml。

39、本发明第五方面，提供了如本发明第一方面所述的工程化的car-t细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症的药物或制剂。

40、在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。

41、在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、小细胞肺癌(sclc)，脑胶质瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、间皮瘤、胰腺癌、或其组合。

42、本发明第六方面，提供了一种提高car-t细胞在缺氧环境中的耐受性的方法，包括步骤：

43、在培养体系中对car-t细胞进行培养t天，t为1～10天，所述培养体系中含有pim抑制剂，收获培养后的car-t细胞。

44、在另一优选例中，所述pim抑制剂的浓度为0.1～10μm，较佳地0.5～5μm，更佳第1～3μm，例如，约2μm。

45、在另一优选例中，t为1～8天，较佳地3～8天，更佳第5～8天，例如，约6天。

46、在另一优选例中，所述pim抑制剂包括azd1208。

47、在另一优选例中，在缺氧环境中，经pim抑制剂处理的car-t细胞的凋亡率(z1)与未经pim抑制剂处理的car-t细胞的凋亡率(z0)相比，两者比例(z1/z0)≤0.9，较佳地≤0.8，更佳地≤0.7。

48、在另一优选例中，经pim抑制剂处理的car-t细胞的肿瘤杀伤能力(p1)与未经pim抑制剂处理的car-t细胞的肿瘤杀伤能力(p0)相比，两者比例(p1/p0)≥1.5，较佳地≥1.8，更佳地≥2.0，最佳地≥2.2。

49、本发明的第七方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，包括给需要治疗的对象施用本发明第一方面所述的car-t细胞。

50、在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。

51、在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、小细胞肺癌(sclc)，脑胶质瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、间皮瘤、胰腺癌、或其组合。

52、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。