一种温敏型整合酶表达载体及其介导的DNA环化方法与流程

本发明属于分子生物学、基因工程及合成生物学，具体涉及一种温敏型整合酶表达载体及其介导的dna环化方法。

背景技术：

1、整合子（integron）是细菌中广泛存在的可移动遗传元件，其编码的整合酶（integrase，如inti1）能够特异性识别atti和attc等重组位点，介导dna片段的剪切、插入与重组。

2、在基因工程与合成生物学研究中，构建环化质粒或质粒文库是常见的技术需求。现有的dna环化技术主要依赖体外限制性核酸内切酶消化与连接、gibson组装或同源重组。这些体外操作往往存在步骤繁琐、成本高、对复杂序列连接效率低等问题。

3、虽然利用整合酶进行体内重组已有探索，但现有的整合酶表达质粒多基于常规的复制起始点（如cole1 ori），在重组完成后该表达质粒会长期稳定存在于宿主细胞中。这不仅给后续目标质粒的提取纯化带来背景质粒干扰，也使得该宿主菌难以直接用于下一轮的克隆操作。

4、此外，已有的整合酶介导环化研究虽然证明了attc位点在位点特异性重组中的作用，但对于能够在细胞内一步式实现线性dna环化并形成可复制环状质粒的稳定工具体系，仍缺乏便于清除、筛选和重复使用的载体平台。

5、因此，开发一种既能在细胞内高效介导含重组酶识别位点线性dna片段的一步式环化，又能在重组完成后被便捷彻底清除的工具载体系统，具有重要的实际应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中体内dna重组载体清除困难、背景干扰大、操作繁琐等缺点，提供一种具有温敏复制特性的整合酶表达载体及其介导的高效、温控可清除的dna体内一步环化方法

2、为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种温敏型整合酶表达载体。所述载体包含：

4、（1）温敏复制起始元件，其使所述载体在第一温度下维持复制，在第二温度下失去复制能力并被清除，其中所述第二温度高于所述第一温度；

5、（2）整合酶表达框架，包含启动子及受所述启动子调控表达的整合酶编码基因。

6、在具体的实施方案中，所述温敏复制起始元件包含rep101ts和psc101 ori。

7、在具体的实施方案中，所述整合酶为i类整合酶inti1或与inti1具有至少85%同一性且具有整合酶活性的突变体。

8、在具体的实施方案中，所述启动子选自可诱导型启动子，例如lac启动子。

9、在具体的实施方案中，所述第一温度为28℃~32℃，优选为30℃，所述第二温度为37℃~43℃，优选为42℃。

10、在具体的实施方案中，所述载体还可含有筛选标记。

11、在优选的实施方案中，所述筛选标记选自氨苄青霉素抗性基因（ampr）或氯霉素抗性基因（cat）。

12、作为具体示例，所述载体以phsint为基础，将其中的cole1 ori替换为来源于pkobeg的rep101ts和psc101 ori，并保留lac promoter驱动的inti1表达框架。

13、在另一个实施方案中，还将phsint中的氨苄青霉素抗性标记替换为来源于pacyc184的氯霉素抗性基因cat，得到载体phsintt-cat。

14、在优选的实施方案中，所述载体的核苷酸序列如seq id no：2或seq id no：3所示。

15、第二方面，本发明提供了一种包含上述温敏型整合酶表达载体的宿主细胞，优选为大肠杆菌（e. coli，如dh5α）。

16、第三方面，本发明提供了一种利用上述载体进行dna分子的体内环化方法，包括：

17、（1）提供待环化的线性dna片段，所述线性dna片段包含至少两个整合酶特异性识别重组位点（如attc位点）；

18、（2）将所述线性dna片段引入含有如本文所述的温敏型整合酶表达载体的宿主细胞中；

19、（3）在第一温度（如30℃）下培养所述宿主细胞，并诱导所述整合酶表达，由所述整合酶介导所述线性dna片段中的重组位点发生位点特异性重组，从而连接获得环化dna产物；

20、（4）将重组后的宿主细胞置于第二温度（如42℃）下培养，可使所述温敏型表达载体失去复制能力，从而有效清除所述温敏型整合酶表达载体。

21、在具体的实施方案中，所述整合酶特异性识别重组位点为attc位点，优选选自attcaada2/3cs位点和attcorff/aada2位点中的至少一种。

22、在具体的实施方案中，所述线性dna片段中还包含复制起始点和/或筛选标记，使环化后形成的环状dna能够在宿主细胞中自主复制和/或可被筛选。

23、在具体的实施方案中，步骤（3）所述诱导使用诱导剂进行。诱导剂可以是例如iptg。

24、在具体的实施方案中，所述环化dna产物的连接位点位于attc保守的5′-aac-3′三联体处。

25、本发明的有益效果

26、1、载体即用即除，背景低：通过引入温敏复制模块，整合酶表达质粒在30℃高效表达并催化重组，在42℃培养下可被有效清除，降低了工具质粒对后续质粒纯化及筛选的背景干扰。

27、2、一步式体内高效环化：无需复杂的体外酶切连接或重组反应，直接将携带两个attc位点的线性dna片段转入宿主菌即可实现体内精确环化。

28、3、特异性高：测序证实，重组连接主要发生在attc保守的5′-aac-3′三联体位点处，表明本发明体系具有较高的位点特异性。

29、4、本发明方法适用于不同来源、不同序列组成的含两个attc位点线性dna片段，具有较好的通用性和扩展性。

30、5、当所述线性dna片段包含筛选标记时，环化后可直接通过相应筛选方式获得目标菌落，从而减少后续克隆构建流程。

1.一种温敏型整合酶表达载体，其特征在于，所述载体包含：

2.根据权利要求1所述的温敏型整合酶表达载体，其特征在于，所述温敏复制起始元件包含rep101ts和psc101 ori。

3.根据权利要求1所述的温敏型整合酶表达载体，其特征在于，所述整合酶为i类整合酶inti1或与inti1具有至少85%同一性且具有整合酶活性的突变体。

4.根据权利要求1所述的温敏型整合酶表达载体，其特征在于，所述启动子为可诱导型启动子；优选地，所述启动子为lac启动子。

5.根据权利要求1所述的温敏型整合酶表达载体，其特征在于，所述第一温度为28℃~32℃，所述第二温度为37℃~43℃。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的温敏型整合酶表达载体，其特征在于，所述载体以phsint为基础，将其中的cole1 ori替换为来源于pkobeg的rep101ts和psc101 ori，并保留lac promoter驱动的inti1表达框架；

7.一种含有根据权利要求1-6中任一项所述的温敏型整合酶表达载体的宿主细胞；

8.一种dna分子的环化方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述整合酶特异性识别重组位点为attc位点，优选选自attcaada2/3cs位点和attcorff/aada2位点中的至少一种。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述线性dna片段中还包含复制起始点和/或筛选标记，使环化后形成的环状dna能够在宿主细胞中自主复制和/或可被筛选；