一种食品接触材料生物效应安全评估方法

本发明涉及食品接触材料安全检测，具体为一种食品接触材料生物效应安全评估方法。

背景技术：

1、食品接触材料在食品生产、包装、储运过程中应用广泛，材料中的各类添加剂以及非有意添加物可通过迁移进入食品，经膳食途径对人体产生潜在健康威胁，其中部分物质能够通过核受体通路引发内分泌干扰、代谢紊乱等不良生物效应，开展食品接触材料的安全评估，对守护食品安全、保障公众身体健康具有重要现实意义，传统评估多采用化学靶向检测手段，随着毒理组学与体外生物测试技术发展，基于生物效应的评价方法逐步成为食品接触材料安全领域的重要研究方向。

2、现有技术大多仅依赖单一化学物质定量检测和法规限量完成风险评判，难以反映多组分混合物的联合生物效应，缺少多靶点结合转录组解析的综合评估方案，存在风险漏判、毒性作用机制不明的缺陷。

技术实现思路

1、（一）解决的技术问题

2、本发明的目的在于提供一种食品接触材料生物效应安全评估方法，以解决上述背景技术中提出传统评估难以反映混合物联合生物效应，缺少多靶点结合转录组的综合评估方案，易发生风险漏判、毒性机制解析不足的问题。

3、（二）技术方案

4、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种食品接触材料生物效应安全评估方法，包括如下步骤：

5、步骤一：样品收集与迁移前处理；

6、步骤二：细胞毒性预实验；

7、步骤三：核受体通路生物效应体外检测；

8、步骤四：高分辨质谱非靶向筛查与风险物质定性定量分析；

9、步骤五：生物等效浓度计算与风险物质效应贡献率解析；

10、步骤六：剂量依赖转录组测序及通路富集分析；

11、步骤七：多维度综合安全风险评估；

12、在步骤一中，需收集塑料基、纸基、硅胶基、铝箔复合类等典型食品接触材料样品，按照基材类型区分食品模拟液，油脂类接触场景选用95%乙醇，水性食品接触场景选用50%乙醇；参照标准开展极限条件迁移实验，设置70℃、2h加速迁移条件，严格执行6dm2/l面积-体积配比，完成迁移液氮吹浓缩、复溶处理，同步设置溶剂空白对照组，完成样品前处理，为后续细胞实验、仪器分析提供合格待测样品。

13、优选的，在步骤二中，选取mvln、hepg2、hek293实验细胞株，采用mtt法开展迁移液样品细胞毒性测试；将细胞接种于96孔板，暴露不同梯度浓度的食品接触材料迁移液，检测细胞存活率，筛选无细胞毒性的样品暴露浓度区间，排除细胞死亡带来的假阳性干扰，确定后续受体报告基因实验、转录组测序的安全暴露浓度。

14、优选的，在步骤三中，分别构建er雌激素受体、pparα/β/γ过氧化物酶体增殖物激活受体双荧光素酶报告基因检测体系；将质粒转染对应宿主细胞后，加入食品接触材料迁移液待测样品，设置阳性参照物质与溶剂空白对照，孵育24h后检测荧光素酶信号，获取受体转录激活倍数，完成食品接触材料迁移液的内分泌、代谢干扰活性初筛，识别存在显著核受体激活效应的高风险样品。

15、优选的，在步骤四中，采用gc-orbitrap-hrms高分辨质谱对待测迁移液开展非靶向筛查；依托保留指数、谱库匹配、标准物质比对，识别迁移液当中潜在风险化学物质；对筛查得到的风险物质建立标准曲线，完成目标物定性、定量检测，得到各类风险物质迁移量数据，筛选出dtbp、dbp、tbc、tbp等高频检出的高风险添加剂与迁移物。

16、优选的，在步骤五中，获取各检出风险物质体外受体激活效应参数，确定每种风险物质相对阳性参照物质的作用效力；分别测算代表样品全部生物活性的整体生物等效水平，以及由已检出化学物质贡献的化学来源生物等效水平；将检出物质贡献的生物活性和样品总生物活性做对比换算，得到各类化学物质的效应贡献占比，区分塑化剂、有机磷酸酯类物质对总内分泌干扰效应的贡献程度，锁定造成样品生物活性的关键致毒物质。

17、优选的，在步骤六中，选取高风险食品接触材料迁移液样品，设置多梯度剂量开展hepg2细胞剂量依赖转录组测序；对测序数据做差异表达基因分析，开展go基因本体、kegg京都通路富集分析，识别脂质代谢、脂肪酸代谢、类固醇激素生物合成、ppars信号通路等受扰动关键通路；依托通路响应特征数值评价样品整体生物扰动效力，从全基因组层面解析食品接触材料迁移混合物的分子扰动机制。

18、优选的，在步骤七中，整合核受体报告基因活性结果、高分辨质谱化学迁移量、物质效应贡献率、转录组通路扰动结果；对比国标规定的各类物质特定迁移限量，同时参考行业已公开的生物等效浓度参考阈值，综合判定样品风险等级；针对婴幼儿高频接触硅胶类等高风险制品，标记预警信号，输出综合安全评估结论，为食品接触材料风险管控提供化学-生物多维度依据。

19、优选的，整套评估方法采用化学仪器分析结合体外细胞生物测试的组合模式，无需动物体内实验；既能够检测已知添加剂，同时可以捕获nias非有意添加物带来的混合物整体生物效应；可识别单一物质浓度达标，但多种物质联合作用产生内分泌、代谢干扰风险的样品；整套流程可实现从样品迁移、靶点活性检测、风险物质溯源到分子机制解析的完整评价，弥补传统仅依靠化学限量评判安全的局限性。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明结合体外细胞生物测试与高分辨质谱化学分析，突破传统仅依靠化学限量开展评价的局限，不仅可检测已知添加剂，还能够识别非有意添加物带来的混合物整体生物效应，避免仅检测单一化学物质造成的风险漏判；同时覆盖雌激素受体er、ppars多重核受体靶点，兼顾内分泌干扰与代谢干扰两类毒性效应，能够筛查出单一组分达标、但多种物质联合作用产生生物活性的高风险食品接触材料样品；并且引入转录组通路分析，从全基因组层面解析迁移混合物的毒性扰动机制，不只给出风险判定结果，还可以定位受干扰的关键生物学通路，为溯源致毒原因提供分子依据；整套评估体系全部采用体外实验，无需动物体内试验，试验周期短，试验成本低，伦理风险小，适合批量开展食品接触材料样品安全筛查，可为食品接触材料风险管控提供多维度技术支撑，进而完善食品接触材料的综合安全评价手段。

1.一种食品接触材料生物效应安全评估方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种食品接触材料生物效应安全评估方法，其特征在于：在步骤二中，选取mvln、hepg2、hek293实验细胞株，采用mtt法开展迁移液样品细胞毒性测试；将细胞接种于96孔板，暴露不同梯度浓度的食品接触材料迁移液，检测细胞存活率，筛选无细胞毒性的样品暴露浓度区间，排除细胞死亡带来的假阳性干扰，确定后续受体报告基因实验、转录组测序的安全暴露浓度。

3.根据权利要求1所述的一种食品接触材料生物效应安全评估方法，其特征在于：在步骤三中，分别构建er雌激素受体、pparα/β/γ过氧化物酶体增殖物激活受体双荧光素酶报告基因检测体系；将质粒转染对应宿主细胞后，加入食品接触材料迁移液待测样品，设置阳性参照物质与溶剂空白对照，孵育24h后检测荧光素酶信号，获取受体转录激活倍数，完成食品接触材料迁移液的内分泌、代谢干扰活性初筛，识别存在显著核受体激活效应的高风险样品。

4.根据权利要求1所述的一种食品接触材料生物效应安全评估方法，其特征在于：在步骤四中，采用gc-orbitrap-hrms高分辨质谱对待测迁移液开展非靶向筛查；依托保留指数、谱库匹配、标准物质比对，识别迁移液当中潜在风险化学物质；对筛查得到的风险物质建立标准曲线，完成目标物定性、定量检测，得到各类风险物质迁移量数据，筛选出dtbp、dbp、tbc、tbp等高频检出的高风险添加剂与迁移物。

5.根据权利要求1所述的一种食品接触材料生物效应安全评估方法，其特征在于：在步骤五中，获取各检出风险物质体外受体激活效应参数，确定每种风险物质相对阳性参照物质的作用效力；分别测算代表样品全部生物活性的整体生物等效水平，以及由已检出化学物质贡献的化学来源生物等效水平；将检出物质贡献的生物活性和样品总生物活性做对比换算，得到各类化学物质的效应贡献占比，区分塑化剂、有机磷酸酯类物质对总内分泌干扰效应的贡献程度，锁定造成样品生物活性的关键致毒物质。

6.根据权利要求1所述的一种食品接触材料生物效应安全评估方法，其特征在于：在步骤六中，选取高风险食品接触材料迁移液样品，设置多梯度剂量开展hepg2细胞剂量依赖转录组测序；对测序数据做差异表达基因分析，开展go基因本体、kegg京都通路富集分析，识别脂质代谢、脂肪酸代谢、类固醇激素生物合成、ppars信号通路等受扰动关键通路；依托通路响应特征数值评价样品整体生物扰动效力，从全基因组层面解析食品接触材料迁移混合物的分子扰动机制。

7.根据权利要求1所述的一种食品接触材料生物效应安全评估方法，其特征在于：在步骤七中，整合核受体报告基因活性结果、高分辨质谱化学迁移量、物质效应贡献率、转录组通路扰动结果；对比国标规定的各类物质特定迁移限量，同时参考行业已公开的生物等效浓度参考阈值，综合判定样品风险等级；针对婴幼儿高频接触硅胶类等高风险制品，标记预警信号，输出综合安全评估结论，为食品接触材料风险管控提供化学-生物多维度依据。

8.根据权利要求1所述的一种食品接触材料生物效应安全评估方法，其特征在于：整套评估方法采用化学仪器分析结合体外细胞生物测试的组合模式，无需动物体内实验；既能够检测已知添加剂，同时可以捕获nias非有意添加物带来的混合物整体生物效应；可识别单一物质浓度达标，但多种物质联合作用产生内分泌、代谢干扰风险的样品；整套流程可实现从样品迁移、靶点活性检测、风险物质溯源到分子机制解析的完整评价，弥补传统仅依靠化学限量评判安全的局限性。