一种用于鉴定尼里-拉菲水牛种质资源的特异分子身份证及其应用

本发明属于水牛品种鉴定领域，具体地，涉及一种用于鉴定尼里-拉菲水牛种质资源的特异分子身份证及其应用。

背景技术：

1、尼里-拉菲水牛是优秀的奶用水牛品种之一，在优势品种的选育过程中，需要探索新的技术和手段为优良品种的培育提供保障。如何快速高效的对畜禽品种进行分子识别和品种鉴定，成为品种能够在生产中进行开发利用和可持续发展的关键。我国水牛养殖目前还没有形成科学的选配选育的方案，导致杂交水牛的遗传背景不清晰，选育水平低，遗传进展非常缓慢。同时，引进的纯种水牛因年限过久及群体规模小，已经出现了一定程度的近交衰退。因此，利用生物信息技术鉴定尼里-拉菲水牛品种独特的遗传特征具有重要意义。

2、单核苷酸多态性（single nucleotide ploymophism，snp）标记是第三代分子标记，是指在基因组dna序列上有单个碱基的突变而产生的一种多态性，这种突变包括单碱基的颠换、转换、插入和缺失。snp具有分布广泛量、高频率、低突变率等特点，广泛应用于基因组分析、生物信息自动化检测、疾病的遗传研究及畜禽育种标记等研究。

3、全基因组关联分析（genome-wide association studies，gwas）是畜禽遗传资源基因组解析常用的重要方法。随着测序技术的发展，全基因组测序技术成为高通量snp分型的有力工具。与此同时，在动物受到长期的自然选择和人工选择时，会在其基因组上留下相应的遗传印记。这些遗传印记通常被称为选择信号。选择信号的研究是基于基因组到表型概念的一种研究策略。

4、专利cn117701737a中公开了一种基于kasp技术筛选水牛snp和构建水牛分子身份证的方法，采用kasp技术等分析方法成功开发出能精准区分全部供试水牛品种的34个snp位点，并可构建了14个水牛品种具有唯一性的二进制和十进制分子身份证，为今后在基因组水平上进行水牛品种精准鉴定、品种资源保护、水牛育种及其种业的发展起到奠定基础的作用，具有重要的现实意义。

5、但由于我国尼里-拉菲水牛表型记录的缺乏和种群规模小，对家畜种质特征的分析日益成为一种重要的方法，构建用于鉴定尼里-拉菲水牛种质资源的特异分子标记具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种用于鉴定尼里-拉菲水牛种质资源的特异分子身份证。

2、本发明的第二个目的在于提供一种用于识别上述特异分子身份证的基因芯片。

3、本发明的第三个目的在于提供一种包含上述基因芯片的试剂盒。

4、本发明的第四个目的在于提供上述特异分子身份证或上述基因芯片或上述试剂盒在鉴定尼里-拉菲水牛种质资源或品种中的应用。

5、本发明的第五个目的在于提供一种鉴定尼里-拉菲水牛品种的方法。

6、本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

7、本发明提供一种用于鉴定尼里-拉菲水牛种质资源的特异分子身份证，所示特异分子身份证包括以下snp位点集合；所述snp的参考基因组版本号为gcf_019923935.1；

8、

9、

10、

11、

12、。

13、

14、本发明以不同水牛品种的基因组dna为研究对象，通过tn5转座酶建库开展全基因组重测序，依托basevar-stitch体系完成snp变异检测与基因型填充，并设置多层严格质控获得高质量群体snp数据集；进一步联合全基因组关联分析（gwas）与群体选择信号分析（fst遗传分化分析）双向筛选品种特异性显著snp位点，并计算每个snp在不同品种中的等位基因频率，筛选等位基因频率在试验组的分布较其他品种高的snp集合作为尼里-拉菲水牛品种的特异性分子身份证，最终得到241个尼里-拉菲水牛专属特异性snp标记，构建得到该品种分子标记。

15、进一步利用该snp特异性分子标记对尼里-拉菲水牛品种进行鉴定，将待检测水牛的基因型数据和尼里-拉菲水牛的基因型数据合并，进行主成分分析，当待检测水牛个体与尼里-拉菲水牛群体的遗传距离近且聚集为一簇时，此时可判定待检测水牛为尼里-拉菲水牛。本发明解决了传统水牛品种鉴定准确度低、特异性差、难以精准区分尼里-拉菲水牛与其他水牛品种的技术问题，可用于尼里-拉菲水牛种质鉴定、品种溯源、种质资源保护与分子辅助育种。

16、进一步地，所述特异分子身份证的筛选方法包括以下步骤：

17、s1.提取不同水牛品种样本的基因组dna，构建全基因组文库并完成全基因组重测序，通过snp变异检测与基因型填充，得到基因分型结果；

18、s2.对步骤s1的基因分型结果分别进行全基因组关联分析与群体选择信号分析，筛选尼里-拉菲水牛特异性显著snp位点，合并两类有效位点后通过品种间等位基因频率差异筛选，即得。

19、更进一步地，所述构建全基因组文库为利用tn5转座酶对样品水牛建立基因文库。

20、更进一步地，所述snp变异检测与基因型填充的方法为采用basevar软件进行snp变异检测，设置dp＞1.5 iqr、eaf＞0.01完成初步过滤；通过stitch算法基于祖先单倍型推断进行基因型填充，限定质控条件为maf＞0.01、info_score＞0.4、call rate＞0.95。

21、更进一步地，所述全基因组关联分析的方法为以尼里-拉菲水牛为试验组、其他水牛品种为对照组，采用gemma软件开展全基因组关联分析，设置两级显著性阈值并结合班费罗尼矫正方法，筛选得到与尼里-拉菲水牛品种显著关联的snp位点。

22、更进一步地，所述群体选择信号分析的方法为采用vcftools软件，以滑动窗口法计算群体遗传分化指数，筛选遗传分化指数排名前2%的显著分化窗口，利用plink软件提取窗口内snp位点，得到品种特异性分化snp位点集合。

23、本发明还提供一种用于识别上述特异分子身份证的基因芯片。

24、本发明还提供一种包含上述基因芯片的试剂盒。

25、本发明还提供上述特异分子身份证或上述基因芯片或上述试剂盒在鉴定尼里-拉菲水牛种质资源或品种中的应用。

26、本发明还提供一种鉴定尼里-拉菲水牛品种的方法，所述方法包括以下步骤：

27、s1.采集待测水牛的血液样本，提取基因组dna，并进行全基因组重测序；

28、s2.利用全基因组重测序数据进行snp分型，并从分型结果中提取上述特异分子身份证上的snp位点；

29、s3.将步骤s2中待检测水牛基因型数据与上述特异分子身份证上的snp位点的基因型进行合并，再进行主成分分析；当待检测水牛个体与尼里-拉菲水牛群体的遗传距离较近，聚集为一簇且远离其他品种时，即为尼里-拉菲水牛。

30、进一步地，所述步骤s1中基因组dna在a260/280的光吸收比在1.8和2.0之间，浓度≥50纳克/微升。

31、本发明提供的方法可简单明了地区分尼里-拉菲水牛与其他水牛品种间的差异，可用于尼里-拉菲水牛品种的真伪鉴定和遗传关系分析，为尼里-拉菲水牛品种的鉴定提供了有效的科学依据。在尼里-拉菲水牛品种鉴定评价时，只需将尼里-拉菲水牛品种与已有的特异性分子身份证比较分析，即可确定其是否为尼里-拉菲水牛品种。这大大降低了尼里-拉菲水牛种质资源鉴定评价的时间和费用，提高了尼里-拉菲水牛品种鉴定评价的效率。

32、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

33、本发明提供一种用于鉴定尼里-拉菲水牛种质资源的特异分子身份证及其应用。本发明以不同水牛品种的基因组dna为研究对象，通过tn5转座酶建库开展全基因组重测序，并完成snp变异检测与基因型填充，获得高质量群体snp数据集；进一步联合全基因组关联分析与群体选择信号分析，双向筛选品种特异性显著snp位点，最终得到241个尼里-拉菲水牛专属特异性snp标记，构建得到该品种分子标记。将该snp分子标记用于尼里-拉菲水牛的品种检测，可简单明了的区分尼里-拉菲水牛与其他水牛品种间的差异，可用于尼里-拉菲水牛品种的真伪鉴定和遗传关系分析。利用本发明的特异分子标记对尼里-拉菲水牛品种鉴定时，大大降低了尼里-拉菲水牛种质资源鉴定评价的时间和费用，提高了尼里-拉菲水牛品种鉴定评价的效率。