一种苦荞源DPP-Ⅳ抑制肽及其应用

本发明属于食源性活性肽，具体涉及一种源自苦荞蛋白的具有二肽基肽酶-iv抑制活性的寡肽及其在制备抑制dpp-iv酶活性产品中的应用。

背景技术：

1、二肽基肽酶-iv（dpp-iv）是治疗ii型糖尿病的关键靶点，该酶通过特异性降解胰高血糖素样肽-1（glp-1）和胃抑制性肽（gip），削弱其促胰岛素分泌的生物活性。目前临床一线药物（如西格列汀、维格列汀等）虽疗效确切，但长期使用可能伴随鼻咽炎、头痛及胃肠道不良反应，且合成成本较高。因此，开发源于天然、安全性高的dpp-iv抑制肽，成为替代或补充化学药物的重要方向。

2、食源性蛋白经酶解或发酵产生的生物活性肽，因副作用小、生物相容性好，被视为潜在的天然降糖因子。苦荞是一种药食同源作物，其蛋白营养价值高，是制备dpp-iv抑制肽的潜在优质来源。在众多制备工艺中，微生物发酵法因其条件温和、特异性强且具有修饰肽段结构的能力，展现出独特优势。

3、微生物分泌的碱性蛋白酶和中性蛋白酶活性高、热稳定性好，能有效切断蛋白质内部的肽键，产生分子量较小的多肽和寡肽，是生成呈味肽和潜在活性肽的关键酶源。豆豉源微生物（特别是某些芽孢杆菌）的蛋白酶对疏水性氨基酸残基（如苯丙氨酸phe、亮氨酸leu、酪氨酸tyr）附近的肽键具有较高的切割特异性。通过优化发酵条件（如ph、温度、时间、底物浓度），有可能调控蛋白酶的表达与活性，从而定向富集含有特定序列特征的苦荞蛋白水解物，提高其中dpp-iv抑制肽的丰度与活性。

4、传统豆豉的发酵体系富含芽孢杆菌（

bacillus）、乳酸菌（

lactobacillus）及霉菌等多种微生物。其中，优势菌（特别是某些芽孢杆菌，如解淀粉芽孢杆菌

bacillus

amyloliquefaciens）在中后期分泌的碱性及中性蛋白酶活性高、热稳定性好，是使蛋白质转化的核心酶类，且对疏水性氨基酸（如phe、leu、tyr）邻近肽键具有特异切割能力。利用上述芽孢杆菌对苦荞蛋白进行定向发酵，可有效调控蛋白酶解进程，定向富集特定序列的寡肽，为制备高活性食源肽提供了一条极具潜力的生物加工途径。

5、然而，现有技术中利用微生物发酵制备苦荞源dpp-iv抑制肽仍面临以下瓶颈：

6、第一，合适的发酵菌剂缺乏。能发酵苦荞蛋白高效产功能寡肽的食源性微生物研究较少。

7、第二，筛选效率与丰度不足。受限于传统发酵及酶解工艺的随机性，目前已从苦荞蛋白中鉴定出的具有明确抑制活性的肽序列极为有限，如lhivgpdk（wu w, wang l, qiuj, et al. exploring dipeptidyl peptidase-iv inhibitory peptides from tartarybuckwheat protein: a study of hydrolysis, fractionation, and molecularinteractions. journal of food science, 2024, 89(12):9108-9119）、lagqs （weijingwu, ju qiu, libo wang, qianglai tan, ziyuan zhuang, yanling wang, lanlan wu.identification and characterization of two novel dipeptidyl peptidase-ivinhibitory peptides from the simulated gastrointestinal digestion of tartarybuckwheat proteins, food chemistry, 2025, 473, 143067）等，且已报道活性肽以长链肽为主，存在分离富集难度大、筛选适配性差等问题，难以满足高通量筛选的需求。

8、第三，苦荞源抑制dpp-iv活性的寡肽数量少且抑制活性有待提升。已报道的苦荞活性肽ic50值多处于毫摩尔至百微摩尔级别（例如寡肽lhivgpdk、lagqs及lreiddadk（weijing wu, ju qiu, libo wang, qianglai tan, ziyuan zhuang, yanling wang,lanlan wu. identification and characterization of two novel dipeptidylpeptidase-iv inhibitory peptides from the simulated gastrointestinaldigestion of tartary buckwheat proteins, food chemistry, 2025, 473, 143067），其ic50值分别为1.61 mm、783.1 μm和425.9 μm，相较于临床应用所需的纳摩尔至微摩尔级活性差距显著，难以直接转化为高效的功能因子。

技术实现思路

1、为了解决现有发酵苦荞蛋白高效产功能寡肽的食源性微生物较少，且苦荞源dpp-iv抑制肽数量少、活性有待提升等问题，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌，且通过整合计算机虚拟筛选与解淀粉芽孢杆菌发酵苦荞蛋白的实验验证，从苦荞蛋白水解物中快速鉴定出具有高抑制活性的新肽段。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明第一方面提供了解淀粉芽孢杆菌，所述的解淀粉芽孢杆菌为四川豆豉来源，分类命名为

bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为cgmcc no.36111。

4、第二方面，本发明提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有所述解淀粉芽孢杆菌。进一步的，所述微生物菌剂中含有所述解淀粉芽孢杆菌的发酵培养液或干燥菌粉。

5、更进一步的，所述发酵培养液的制备方法包括如下步骤：将解淀粉芽孢杆菌接种到改良pda液体培养基中，37℃培养后得到发酵培养液。

6、更进一步的，所述发酵培养液为发酵上清液或菌悬液，所述发酵上清液为将所述发酵培养液经离心得到；所述菌悬液是将发酵培养液离心后的沉淀重悬后得到。

7、第三方面，本发明提供以下一种以上成分在制备苦荞发酵产品中的应用。

8、（1）所述解淀粉芽孢杆菌；

9、（2）所述解淀粉芽孢杆菌的发酵培养液或干燥菌粉；

10、（3）含有所述解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂。在更进一步的方案中，所述微生物菌剂为解淀粉芽孢杆菌菌悬液。

11、本发明第四方面提供了一种苦荞源dpp-iv抑制肽的制备方法，包括如下步骤：

12、（1）制备微生物菌剂；所述的微生物菌剂为解淀粉芽孢杆菌菌悬液，制备方法包括：将解淀粉芽孢杆菌接种到改良pda固体培养基上培养，取单菌落转接至改良pda液体培养基，连续传代培养，离心、洗涤、重悬，得解淀粉芽孢杆菌菌悬液。所述活化培养和传代培养，均在37℃下进行，培养时间为24 h。

13、（2）苦荞蛋白发酵：向灭菌后的苦荞粗蛋白溶液中加入步骤（1）中的微生物菌剂，混匀后进行液态发酵，得到苦荞蛋白发酵液。本步骤中所述苦荞粗蛋白的制备方法：将干燥的苦荞籽粒打粉后过筛后获得苦荞粉；将苦荞粉依次进行脱脂、沉淀、固液分离、滤液超高速离心、真空冷冻干燥处理，得到苦荞粗蛋白粉末；然后将苦荞粗蛋白粉末溶解即得苦荞粗蛋白溶液。

14、所述苦荞粗蛋白溶液的浓度为40 g/l。所述灭菌条件为90℃灭菌10 min。所述的微生物菌剂的添加量为所述苦荞粗蛋白溶液总体积的7%（v/v），所述微生物菌剂的浓度为1.0×107 cfu/ml。所述的液态发酵的条件为：40℃、200 r/min条件下摇床发酵培养24 h。

15、（3）超滤分离：将（2）中所述发酵液过滤，收集分子量设定截留值的肽段混合物；所述过滤采用0.22 μm微滤膜（pes 材质）。所述设定截留值为3 kda和10 kda，经超滤处理后得到分子质量≤3kda、分子质量在3kda（不含）～10kda（含）范围内和分子质量＞10kda三个超滤组分，选用<3kda组分进行后续实验。

16、（4）肽段鉴定与虚拟筛选：对步骤（3）获得的肽段混合物进行质谱鉴定，获得肽段序列信息；随后利用活性预测模型及分子对接等方法进行虚拟筛选，预测筛选潜在活性肽；所述质谱鉴定为lc-ms/ms技术。

17、所述活性预测模型具体为：

18、s1、将得到的寡肽进行初步筛选；筛选n末端第一位氨基酸为缬氨酸，第二位氨基酸为脯氨酸，长度为3-7个氨基酸的肽段。

19、s2、采用biopep-uwm数据库对步骤s1筛选出的肽段进行综合模拟评分；选留评分≥0.5的肽段。

20、s3、对步骤s2筛选出的肽段进行疏水性、毒性、致敏性、细胞穿透性预测；具体使用gravy calculator工具进行平均疏水值预测；使用toxinpred3.0工具进行毒性预测；使用allercatpro 2.0工具进行致敏性预测，使用pepadmet工具进行细胞穿透性预测。优选平均疏水值高（得分≥-0.5的肽段）、无毒性、无致敏性、渗透率指标log10 (papp)值＞-7的肽段。

21、s4、将步骤s3得到的dpp-iv抑制肽活性预测，选用stackdppiv评分≥0.5的活性肽。

22、s5、将步骤s4得到的dpp-iv抑制肽进行分子对接模拟，优选最佳结合能≤-5.0kcal/mol的肽段。具体使用autodock vina进行分子对接。

23、（5）体外活性验证：化学合成或分离步骤（4）预测得到的潜在活性肽，通过体外dpp-iv 抑制实验评价其活性并解析构效关系。筛选策略上，尽管寡肽 vpe 的 biopep-uwm预测得分仅为 0.33，但综合考虑其理化参数及其他软件预测结果均符合活性肽特征，故予以保留并进行实验验证。所述体外dpp-iv抑制实验包括体外酶学水平实验及caco-2细胞单层原位水平实验，采用体外dpp-iv抑制实验以测定潜在活性肽的ic50值，即半数抑制浓度。基于所述ic50及酶动力学参数解析所述潜在活性肽的构效关系。所述构效关系解析包括则结合lineweaver-burk双倒数作图法判定抑制类型，并利用分子对接技术可视化肽-酶相互作用模式。

24、本发明通过构建的“肽组学+虚拟筛选+体外活性验证”的集成模型筛选出了14条能与dpp-iv酶有效结合并抑制其酶活性的苦荞蛋白源寡肽。因此本发明提供一种苦荞源dpp-iv抑制肽，（1）所述dpp-iv抑制肽的氨基酸序列为以下任一项所示：vpm、vpsf（seq idno:1）、vpml（seq id no:2）、vpma（seq id no:3）、vpvl（seq id no:4）、vpmi（seq id no:5）、vplg（seq id no:6）、vpvi（seq id no:7）、vpe、vpif（seq id no:8）、vpildtl（seq idno:9）、vpvlpq（seq id no:10）、vpgi（seq id no:11）、vptmi（seq id no:12）；（2）对（1）所述的氨基酸序列进行化学法或酶法修饰获得，且具有dpp-iv抑制活性的衍生物；（3）与（1）所述的氨基酸序列具有至少80%序列同一性，且保留dpp-iv抑制活性的突变体。

25、本发明又提供了上述dpp-iv抑制肽在制备抑制dpp-iv酶活性产品中的应用。所述产品为食品、药品、化妆品或保健品。进一步的，所述药品为预防、缓解或治疗ii型糖尿病的药物。

26、本发明还提供了一种产品，所述产品包含上述至少一种dpp-iv抑制肽，以及食品上、药学上、化妆品上或保健品上可接受的辅料、载体或赋形剂。

27、本发明具有以下有益效果：

28、1. 筛选效率高、成本低：本发明的“干湿结合”策略（肽组学鉴定+计算机虚拟筛选+体外实验验证），能够从海量肽段序列中快速聚焦潜在的高dpp-iv抑制活性目标，大幅减少了盲目、大规模的体外筛选工作量，显著提高了活性肽的发现效率，降低了时间与物质成本。

29、2. 活性肽段资源得到拓展：本发明从苦荞蛋白中成功鉴定出多个全新的dpp-iv抑制肽序列，丰富了植物源dpp-iv抑制肽的库容，为后续结构优化与构效关系研究提供了重要的物质基础。

30、3. dpp-iv抑制肽活性高：本发明实施例筛选的dpp-iv抑制肽的ic50值为14.83～258.37 μm，与临床应用所需的活性差距非常小。其中寡肽vpvlpq在体外酶学水平的ic50值低至14.83 μm，在caco-2细胞模型中的ic50值达62.13 μm；寡肽vptmi在体外酶学水平的ic50值低至25.61 μm，在caco-2细胞模型中的ic50值达53.48 μm。

31、4. 提升了资源附加值与利用率：本发明为苦荞蛋白的高值化利用提供了具体路径，通过定向转化获得高活性功能肽，显著提升了苦荞的加工附加值，为杂粮作物的深度开发和农业资源综合利用开辟了新途径。

32、5. 应用前景广泛：所获得的dpp-iv抑制肽可直接或作为关键成分，用于开发治疗ⅱ型糖尿病及其相关代谢性疾病的药物、具有辅助降血糖功能的保健食品或特殊医学用途配方食品，在医药、食品及保健品等领域具有广阔的市场潜力和社会经济效益。