一种ScCas12a蛋白及其应用

本发明涉及基因编辑，特别是一种sccas12a蛋白及其应用。

背景技术：

1、成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats, crispr）系统是广泛存在于细菌和古菌基因组中的适应性免疫系统。crispr系统主要可分为class1和class2两种类型，其中class2类型的crispr系统仅需单一的cas效应蛋白即可发挥核酸切割功能，因此被广泛用于真核生物的基因编辑。class2类型crispr系统的cas效应蛋白主要包括typeⅱ类的cas9、typeⅴ类的cas12和typeⅵ类的cas13。

2、cas12a（又称cpf1）是一类近年来备受关注的crispr效应蛋白。与cas9相比，cas12a具有以下独特优势：（1）cas12a识别富含胸腺嘧啶（t）的原位邻近基序（protospaceradjacent motif, pam）序列，在at含量较高的基因组区域具有更好的靶向能力；（2）cas12a仅需成熟的crrna即可引导蛋白识别靶点，无需tracrrna；（3）cas12a在靶点处切割产生粘性末端，有利于同源重组修复介导的基因定点敲入；（4）cas12a具有更低的脱靶率；（5）cas12a在切割靶向双链dna后会激活反式切割活性，非特异性地切割周围的单链dna，这一特性使其成为核酸检测的理想工具。

3、然而，现有cas12a系统在实际应用中仍存在诸多技术瓶颈：

4、首先，现有cas12a效应蛋白的pam识别范围较为狭窄，严重限制了其靶向位点的选择范围。目前最常用的lbcas12a和ascas12a均严格识别tttv（v=a/c/g）或ttn的pam序列，这限制了cas12a的基因靶向能力，使其仅能覆盖约1%的基因组靶点。在基因组中，符合ttn或tttn序列的位点数量有限，尤其在gc含量较高的基因组区域（如许多植物基因组和微生物基因组），可靶向位点数量进一步减少。尽管已有研究尝试通过蛋白质工程手段拓宽cas12a的pam识别范围，但现有pam拓宽策略往往伴随着催化活性的降低，且不同cas12a同源物的结构差异使得已知的改造策略难以直接移植。因此，鉴定和开发具有更宽pam识别范围的新型cas12a效应蛋白，是本领域亟待解决的技术问题。

5、其次，现有cas12a同源物在水稻等植物中的基因编辑效率普遍偏低，限制了其在植物基因组编辑和分子育种中的应用。lbcas12a和fncas12a在植物细胞中的编辑效率远低于cas9。虽然近年来陆续有研究者报道了一些新型cas12a同源物在植物中的编辑效率数据，但总体而言，兼具高编辑效率和宽pam识别范围的cas12a工具仍然匮乏。因此，开发一种在植物中具有高编辑效率且pam范围更宽的cas12a蛋白，对于植物基因功能研究和分子育种具有重要意义。

6、再者，基于cas12a反式切割活性的核酸检测技术，其检测灵敏度不足，通常需要依赖靶核酸预扩增步骤。现有cas12a核酸检测系统的检测灵敏度通常仅达到皮摩尔（pm）水平，远不能满足临床诊断和早期疾病筛查的需求。为此，研究者通常需要将cas12a检测与pcr、rpa或lamp等核酸扩增技术联用。这不仅增加了操作步骤和检测时间，还引入了扩增偏差和交叉污染的风险。因此，开发一种具有更高反式切割活性的cas12a蛋白，对于提升核酸检测灵敏度、实现免预扩增检测具有重要意义。

7、综上所述，本领域亟需鉴定和开发一种新型crispr/cas12a蛋白，其应具备更宽的pam识别范围、更高的植物基因编辑效率以及更优的核酸检测性能，以克服现有技术的上述缺陷。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种sccas12a蛋白及其应用。

2、为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

3、本发明提供的第一个技术方案是一种sccas12a蛋白，所述sccas12a蛋白具有以下序列之一的氨基酸序列：

4、（a）如seq id no.1所示的氨基酸序列；

5、（b）与seq id no.1具有至少95%序列同源性且具有核酸切割功能的氨基酸序列；

6、（c）在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上经过一个或多个氨基酸的替换、缺失或添加后仍保留与seq id no.1相同的核酸切割功能的氨基酸序列。

7、优选地，所述sccas12a蛋白为sccas12a-vv突变体蛋白，其氨基酸序列如seq idno.7所示。

8、需要说明的是：

9、本发明的蛋白可以进行衍生化，通常，蛋白的衍生化不会影响蛋白的活性，如与sgrna结合形成复合物的活性、在sgrna的引导下对核酸进行切割的活性。因此，可将本发明的蛋白与不同的分子基团进行连接，如与核定位信号（nls）序列进行连接，使本发明的蛋白和进入真核生物细胞的细胞核中；与各种标签进行连接，如his标签，gst标签或者mbp标签进行连接，以便本发明的蛋白的表达和纯化。优选地，本发明所述sccas12a蛋白连接有his标签。

10、通常，将一种蛋白与另一种蛋白进行融合，可保留蛋白原有的活性（如与sgrna结合形成复合物的活性、在sgrna引导下识别特定核酸序列并进行切割的活性）。因此，本发明的蛋白还欲包括此类融合的形式。

11、特别地，可将本发明的蛋白与各种具有活性结构与的多肽进行结合，如转录激活结构域、转录抑制结构域进行融合，使其具有转录激活或者转录抑制的能力；与核苷酸脱氨酶进行结合，使其具有对靶点序列进行碱基修饰的活性；以便对靶点序列进行单碱基的编辑。

12、本发明提供的第二个技术方案是一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码上述sccas12a蛋白的核苷酸序列，所述核酸分子具有以下序列之一的核苷酸序列：

13、（a）如seq id no.2或seq id no.5所示的核苷酸序列；

14、（b）如seq id no.3或seq id no.4所示的密码子优化核苷酸序列；

15、（c）与seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4或seq id no.5相比具有一个或者多个碱基的置换、缺失或者添加的核苷酸序列；或与seq id no.2、seq id no.3、seq idno.4或seq id no.5相比具有至少70%序列同一性且编码具有核酸切割功能蛋白的核苷酸序列。

16、本发明提供的第三个技术方案是一种重组载体，所述重组载体包含上述核酸分子。

17、本发明提供的第四个技术方案是一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含上述重组载体，或其基因组中整合有上述核酸分子。

18、本发明提供的第五个技术方案是上述sccas12a蛋白或上述核酸分子在制备基因编辑工具或核酸检测工具中的应用。

19、本发明提供的第六个技术方案是一种基因编辑方法，所述方法包括将所述的sccas12a蛋白或其编码序列导入靶细胞，使所述sccas12a蛋白在引导rna的引导下识别靶核酸序列的原位邻近基序并进行切割。

20、进一步地，所述的基因编辑方法中，所述sccas12a蛋白为seq id no.1所示的sccas12a蛋白时，其识别的原位邻近基序为5’-ttn-3’，其中n为a/t/c/g；

21、所述sccas12a蛋白为seq id no.7所示的sccas12a-vv突变体蛋白时，其识别的原位邻近基序为5’-dtn-3’，其中d为a/t/g。

22、本发明提供的第七个技术方案是一种基于crispr/cas12a的核酸检测系统，所述系统包含：

23、所述的sccas12a-vv突变体蛋白或其编码序列；

24、引导rna，所述引导rna包含能够与靶核酸序列杂交的引导序列；

25、信号报告分子，所述信号报告分子为带有荧光基团和淬灭基团的单链dna；

26、scaffold rna；

27、tcc-crrna，所述tcc amplifier为具有双茎环结构的dna寡聚核苷酸；

28、所述系统利用sccas12a-vv突变体蛋白在引导rna引导下识别靶核酸后激活的反式切割活性，切割信号报告分子产生可检测信号。

29、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

30、1）本发明提供了一种来源于sedimentisphaera cyanobacteriorum菌株的新型cas12a效应蛋白sccas12a，与已知cas12a同源物的序列相似性低，丰富了crispr/cas12a的效应蛋白工具库；sccas12a识别5’-ttn-3’的pam序列，具有典型的cas12a核酸切割活性（顺式切割和反式切割），并在水稻基因组中实现了基因编辑。

31、2）本发明还提供了一种pam识别范围更宽的sccas12a-vv突变体蛋白，通过将sccas12a的第205位和第567位赖氨酸突变为缬氨酸，成功将pam识别序列从5’-ttn-3’拓宽至5’-dtn-3’（d=a/t/g），pam覆盖范围从3种（tta/ttc/ttg）拓展至9种（ata/atc/atg、tta/ttc/ttg、gta/gtc/gtg），靶向位点覆盖率显著提升。sccas12a-vv在水稻原生质体中的编辑效率是sccas12a的1.7倍，在稳定转基因水稻中的编辑效率达到65%，显著优于sccas12a和已有报道的多种cas12a同源物。

32、3）本发明展示了sccas12a-vv突变体蛋白在核酸检测中的优越性能，sccas12a-vv在35 ℃至50 ℃的宽温度范围内均保持反式切割活性，在37.5 ℃时活性最高；其体外核酸检测活性高于lbcas12a和fncas12a；sccas12a-vv突变体蛋白对单碱基错配具有良好的分辨能力；sccas12a-vv在atn、ttn、ctn和gtn四种pam下均具有核酸检测活性，pam识别范围显著优于lbcas12a（仅ttn和ctn）和fncas12a（仅ttn）。

33、4）本发明构建的核酸检测系统，tnh放大器在sccas12a-vv的体外检测体系中，显著放大了荧光信号的强度，提高了体外检测系统的灵敏度。