一种靶向ANXA2和CD147的双特异性嵌合抗原受体及其应用

本发明涉及细胞免疫治疗和肿瘤治疗，具体涉及一种靶向anxa2和cd147的双特异性嵌合抗原受体及其应用。

背景技术：

1、骨肉瘤是一种高度恶性的骨源性恶性肿瘤，侵袭性强，易发生远处转移，预后较差。现有标准治疗方式主要包括手术切除联合化疗，但部分患者仍存在复发、转移和治疗反应不佳等问题。因此，开发新的治疗策略对于提高骨肉瘤患者生存率具有重要意义。

2、t细胞是参与细胞免疫的一类重要的淋巴细胞，通过抗原呈递细胞的信号传递，可以特异性地识别并杀伤肿瘤细胞。嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor tcell, car-t)疗法是通过采集外周血单个核细胞，体外分离t细胞后，将设计的car基因通过慢病毒、逆转录病毒转染或电穿孔等方式导入t细胞，使t细胞表达car分子，再经扩增后回输至受试者体内以实现抗肿瘤治疗。car分子通常包括胞外抗原识别结构域、跨膜结构域以及胞内信号结构域，其中胞外抗原识别结构域决定car-t细胞的抗原识别范围和特异性。

3、实体瘤具有明显异质性。单靶向car-t细胞往往难以覆盖所有肿瘤细胞亚群，可能导致抗原阴性或低表达细胞逃逸，进而造成治疗后复发或耐药。双靶向car-t细胞能够通过识别两个不同抗原扩大肿瘤识别范围，其中串联car可将两个抗原结合结构域整合在同一car分子中，使t细胞在识别任一靶抗原时被激活，从而增强抗肿瘤能力。公布号为cn113498418a的发明专利，公开了一种新的嵌合抗原受体(car)及其在转移性骨肉瘤的治疗中的用途，其中所述car包含抗原结合域、铰链域、跨膜域、胞内信号转导域和任选地一个或多个共刺激信号转导域，所述抗原结合域包含tp1 scfv-片段或者tp3 scfv-片段。实验数据显示，该发明所述car在免疫细胞表面上被表达时，这些免疫细胞可以针对骨肉瘤细胞。在鼠科腹膜内模型中，对于表达包含来自tp1或tp3抗体的scfv的car的t细胞，肿瘤生长显著延缓。表达所述car的免疫细胞以模拟转移性骨肉瘤的鼠科模型中的肿瘤体积减小的形式显示出治疗效果。

4、然而，骨肉瘤领域中有效的双靶向car-t治疗方案仍然有限。

5、anxa2是一种膜联蛋白家族成员，在多种肿瘤中高表达，并与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和转移相关。cd147又称basigin，是一种跨膜糖蛋白，在多种肿瘤细胞中异常高表达，并与肿瘤侵袭、转移、免疫抑制微环境及基质重塑密切相关。现有技术中尚缺乏将anxa2和cd147作为组合靶点用于骨肉瘤car-t治疗，尤其是用于抑制骨肉瘤淋巴结转移和患者来源异种移植瘤生长的系统性方案。

6、因此，亟需提供一种能够同时识别anxa2和cd147、扩大骨肉瘤细胞识别范围并增强体内外抗骨肉瘤效果的双特异性嵌合抗原受体。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种靶向anxa2和cd147的双特异性嵌合抗原受体及其应用。

2、第一个方面，本发明提供一种靶向anxa2和cd147的双特异性嵌合抗原受体，其包括能够结合anxa2的第一抗原结合结构域、能够结合cd147的第二抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和信号转导结构域；其中，所述第一抗原结合结构域包含如seqid no：1所示的氨基酸序列或由seq id no：2所示核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述第二抗原结合结构域包含如seq id no：5所示的氨基酸序列或由seq id no：6所示核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域通过刚性连接肽连接；

3、所述信号转导结构域为信号转导结构域。

4、所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域均为scfv（单链可变区片段）。在本技术中，第一抗原结合结构域也称为anxa2 scfv，第二抗原结合结构域也称为cd147scfv。进一步地，所述第一抗原结合结构域位于所述第二抗原结合结构域的n端外侧，两者通过刚性连接肽连接。

5、进一步地，所述铰链区可以是选自cd8α或igg铰链区，优选为igg4 铰链区，更进一步为igg4 铰链区/fc spacer 区，其氨基酸序列如seq id no：3所示（对应seq id no：7中第 553~780 位），其核苷酸序列对应为seq id no：8 中第 1657~2340 位。

6、进一步地，所述跨膜结构域可以是选自cd8α、cd28、cd137或 icos跨膜结构域，优选为cd8α 跨膜结构域，其氨基酸序列如seq id no：4所示（对应seq id no：7中第 781~804位），其核苷酸序列对应为seq id no:8 中第 2341~2412 位。

7、进一步地，所述共刺激结构域可以是选自4-1bb、cd28、ox40、icos和cd27共刺激结构域中的一种或两种以上的组合，更优选为4-1bb共刺激结构域。

8、进一步地，所述刚性连接肽为包含eaaak重复单元的α-螺旋型刚性连接肽，更优选为。

9、在一个优选实施例中，所述双特异性嵌合抗原受体从n端至c端依次包括第一抗原结合结构域、、第二抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、4-1bb共刺激结构域和信号转导结构域。

10、在另一优选实施例中，所述双特异性嵌合抗原受体如seq id no：7所示。

11、第二个方面，本发明提供一种编码上述第一方面所述双特异性嵌合抗原受体的核酸。

12、进一步地，所述核酸如seq id no：8（不含 kozak）或seq id no：9（含 kozak）所示。

13、第三个方面，本发明提供一种表达载体，其包含上述第二方面所述的核酸。

14、进一步地，所述表达载体为病毒载体；更优选地，所述病毒载体为慢病毒载体。

15、第四个方面，本发明提供一种免疫细胞，其用上述第二方面所述核酸转导，或者是包含上述第三方面所述的表达载体，或者是表达上述第一方面所述的双特异性嵌合抗原受体。

16、进一步地，所述免疫细胞选自t细胞、nk细胞、nkt细胞和巨噬细胞中的一种或两种以上的组合，更优选地，所述免疫细胞为t细胞。

17、第五个方面，本发明提供一种药物组合物，其包括上述第四方面所述的免疫细胞。

18、第六个方面，本发明提供上述第一方面所述的双特异性嵌合抗原受体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的免疫细胞、或者是第五方面所述的药物组合物在制备用于治疗骨肉瘤的药物中的应用。

19、进一步地，所述骨肉瘤为anxa2阳性和/或cd147阳性的骨肉瘤。

20、进一步地，是在制备用于治疗原发性骨肉瘤、复发性骨肉瘤、转移性骨肉瘤或伴淋巴结转移的药物中的应用。

21、进一步地，所述药物用于抑制骨肉瘤细胞增殖、杀伤骨肉瘤细胞、抑制骨肉瘤肿瘤生长、抑制骨肉瘤转移、抑制骨肉瘤淋巴结转移或它们的组合。

22、第七个方面，本发明提供一种制备双特异性car-t细胞的方法，包括如下步骤：获得t细胞；将第二方面所述的核酸或第三方面所述的表达载体导入所述t细胞；培养扩增经导入的t细胞，即得到表达所述的双特异性car-t细胞。

23、进一步地，所述t细胞来源于外周血单个核细胞，通过cd3阳性分选获得。

24、进一步地，所述表达载体通过慢病毒转导导入t细胞。

25、进一步地，所述t细胞在转导前经cd3/cd28激活剂和il-2激活，转导时moi为约10。

26、本发明所述双特异性car-t细胞在体外与anxa2阳性和/或cd147阳性的骨肉瘤细胞接触后，较单靶向anxa2 car-t细胞或单靶向cd147 car-t细胞产生更高的细胞毒性和/或更高水平的tnfα、gzmb效应因子。

27、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

28、1.本发明基于单细胞测序、公共数据集、流式细胞术、qrt-pcr和免疫组化验证，确定anxa2和cd147在骨肉瘤原发灶及转移淋巴结中高表达，为骨肉瘤car-t治疗提供新的联合靶点。

29、2.本发明构建的anxa2-cd147双特异性car-t细胞能够以“or”逻辑识别anxa2和cd147中的至少一种抗原，扩大对异质性骨肉瘤细胞的识别范围。

30、3.本发明所述的双特异性car-t细胞在抗原双阳性骨肉瘤细胞中表现出较单靶向car-t细胞更强的杀伤能力，并分泌更多gzmb和tnfα等效应因子。

31、4.本发明所述的双特异性car-t细胞在cdx模型、爪垫淋巴结转移模型和pdx模型中均表现出显著抗骨肉瘤效果，可抑制肿瘤生长并降低淋巴结转移。

32、5.在动物实验中，输注本心知肚明所述双特异性car-t细胞后未观察到明显肝肺损伤或严重毒性反应，提示其具有较好的应用前景。