禾谷类广谱抗病虫功能主效基因、连锁分子标记及分子设计育种双重应用体系的制作方法

本发明属于作物分子遗传育种与植物生物，尤其涉及禾谷类广谱抗病虫功能主效基因、连锁分子标记及分子设计育种双重应用体系。

背景技术：

1、禾谷类作物是我国第一大粮食作物品类，总产量占全国粮食总产量的90%以上，其稳产性直接关系国家粮食安全。病虫害是制约禾谷类作物产量与品质的核心生物胁迫因素，常年因病害、虫害造成的产量损失达总产量的10%~30%，重病虫年份局部区域减产可达50%以上。传统化学防治方式不仅增加农业生产成本，还易引发农药残留、环境污染、病虫抗药性上升等一系列问题，培育抗病虫作物品种是当前公认的最经济、绿色、安全的病虫害防控途径。

2、现有抗病虫育种技术仍存在三方面显著不足：其一，广谱主效基因资源匮乏，已克隆的抗病虫基因多为专化性抗性基因，仅能对抗单一病虫或少数生理小种/生物型，易因病原物变异、害虫生物型进化而丧失抗性，抗性持久性差，同时兼具抗病、抗虫功能的广谱主效基因数量极少，无法满足多病虫复合发生区域的育种需求；其二，实用型分子标记不足，多数已开发的抗病虫连锁标记与目标基因遗传距离较大，通常大于2cm，基因型选择准确率低于90%，且多为显性标记，无法区分纯合与杂合基因型，缺乏适配高通量自动化检测的标记类型，难以支撑大规模商业化育种应用；其三，基因研究与育种应用脱节，现有技术多聚焦于基因的功能机制解析，缺乏标准化的育种应用配套技术，或仅开发标记用于辅助选择，未对基因功能进行深度挖掘与定向改造，尚未形成覆盖种质创新到品种改良全流程的一体化应用体系，基因资源从发现到产业化应用的周期长达8~10年，转化效率低，且育种路径单一，无法同时适配不同育种主体的技术条件与监管要求。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，旨在解决三个核心技术问题：一是解决禾谷类抗病虫基因抗性谱窄、主效广谱基因资源不足、抗性持久性差的问题；二是解决现有分子标记与目标基因连锁不紧密、选择准确率低、检测通量不足的问题；三是解决基因功能研究与育种应用脱节、缺乏一体化应用体系、育种周期长、适配场景单一的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明提供一种禾谷类广谱抗病虫分子设计育种双重应用体系，包括广谱抗病虫主效功能基因bsdr1、与所述bsdr1紧密连锁的共显性分子标记组，以及功能基因定向改良模块和分子标记辅助育种模块。

4、所述bsdr1为禾谷类作物中天然存在的细胞膜定位模式识别受体编码基因，通过识别病原真菌相关分子模式与昆虫取食相关分子模式激活植物mapk基础免疫通路，上调植保素合成基因、昆虫取食抑制蛋白基因的表达，同时调控活性氧积累与胼胝质沉积，从物理屏障、化学防御两个层面介导对多种真菌病害与多种农业害虫的广谱显性抗性；该基因为显性主效基因，对抗病虫表型的贡献率为35%~50%，杂种一代即可表现明显抗性，适配杂交禾谷类作物的育种需求。

5、进一步地，所述bsdr1基因介导的抗性谱至少覆盖：真菌病害中的水稻稻瘟病、水稻纹枯病、小麦条锈病、小麦白粉病、玉米大斑病、玉米小斑病中的三种及以上；农业害虫中的水稻褐飞虱、水稻二化螟、小麦麦长管蚜、玉米螟中的两种及以上。

6、进一步地，所述bsdr1基因存在bsdr1-hap1优异单倍型；所述优异单倍型的启动子区域存在天然表达调控变异，使基因的表达量较栽培种普通单倍型上调2~3倍，对应作物的抗病虫抗性等级提升2~3级，为育种利用的核心优异变异。

7、进一步地，所述bsdr1基因在水稻、小麦、玉米的同源染色体共线性区段存在功能同源基因，在禾谷类作物中具有广谱抗病虫功能的保守性。

8、所述共显性分子标记组基于bsdr1基因侧翼基因组的天然插入缺失多态性位点开发，与bsdr1基因的遗传距离小于0.5cm，物理距离小于80kb，标记基因型与抗病虫表型共分离；所述分子标记组可区分纯合抗病、杂合、纯合感病三种基因型，在分离群体中表型选择准确率≥98%，在自然种质群体中表型符合率≥97%。

9、进一步地，所述共显性分子标记组包含bsdr1-indel1标记和bsdr1-k1标记；

10、所述bsdr1-indel1为普通pcr-indel标记，通过凝胶电泳判读基因型，适配中小规模育种群体检测；

11、所述bsdr1-k1为高通量kasp荧光标记，通过荧光信号判读基因型，适配96/384孔板自动化高通量检测平台。

12、所述功能基因定向改良模块用于通过挖掘bsdr1的天然优异变异或定向调控bsdr1的基因功能，创制广谱抗病虫种质材料，包含三种可独立实施的技术路径：

13、1、天然优异等位变异筛选路径：利用bsdr1单倍型检测标记，在禾谷类种质资源库、地方品种或野生近缘种群体中进行高通量筛选，鉴定携带bsdr1-hap1优异单倍型的种质材料，直接作为抗病虫育种供体；

14、2、内源基因定向编辑路径：采用基因编辑技术，对受体作物内源bsdr1基因启动子区的负调控顺式作用元件进行精准敲除，或对编码区的关键负调控位点进行定点替换，在不导入外源基因的前提下，增强bsdr1的基因表达水平或蛋白活性，定向提升受体作物的广谱抗病虫性；

15、3、基因过表达强化路径：构建携带bsdr1-hap1优异等位型的植物表达载体，通过农杆菌介导或基因枪法进行遗传转化，获得bsdr1基因过表达株系，创制高抗等级的广谱抗病虫种质材料。

16、所述分子标记辅助育种模块用于利用所述共显性分子标记组开展基因型精准选择，实现抗病虫性状的高效转育与多基因聚合，包含三种可独立实施的应用流程：

17、1、标记辅助回交转育流程：以携带bsdr1优异等位基因的材料为供体、以主栽品种为轮回亲本，在各回交世代利用所述共显性分子标记组进行前景选择，筛选携带目标基因的单株；同时利用全基因组分子标记进行背景选择，筛选基因组回复率最高的单株进入下一世代，快速培育遗传背景纯净的抗病虫近等基因系；

18、2、多基因聚合育种流程：将bsdr1的共显性分子标记与其他抗病、抗虫、高产、优异性状基因的连锁标记组合，建立多基因分子检测体系；在杂交分离世代同时进行多基因的基因型选择，快速聚合多个有利基因，培育综合性状优良的持久抗性品种；

19、3、早期世代联合选择流程：在杂交低世代苗期，同步开展bsdr1目标基因的前景选择与全基因组背景筛选，提前淘汰非目标单株，缩小后续田间种植与表型鉴定的群体规模。

20、所述功能基因定向改良模块与分子标记辅助育种模块可独立实施，也可联动配合；联动配合的实施方式为：先通过功能基因定向改良模块创制携带bsdr1优异等位基因的核心供体种质，再通过分子标记辅助育种模块将目标基因转育到不同生态区的主栽品种中，实现种质创新—品种改良—产业应用的一体化推进，覆盖从种质创新到品种培育的全育种流程。

21、采用上述结构后，本发明有益效果如下：

22、（1）本发明鉴定的bsdr1为同时介导抗病、抗虫的主效广谱基因，突破了单一基因抗性谱窄的局限；其介导的基础免疫抗性属于非专化性抗性，不易被病原物或害虫克服，抗性持久性显著优于传统专化性抗性基因，可有效延长作物品种的田间使用年限。

23、（2）本发明开发的共显性分子标记与目标基因紧密连锁，选择准确率≥98%，可在苗期进行无损伤检测，无需人工接虫接菌，不受环境条件影响；同时提供普通凝胶型与高通量型两类标记，适配科研单位、种业企业等不同主体的检测条件与规模需求。

24、（3）本体系同时覆盖基因工程改良与常规分子育种两大路径，既可以通过基因编辑快速改良主栽品种，也可以通过标记辅助选择进行常规育种，适配不同的监管要求与育种目标；体系标准化程度高，可直接嵌入商业化育种流程，将抗病虫品种培育周期从传统的6~8年缩短至2~3年，整体育种效率提升3倍以上。

25、（4）应用本体系培育的抗病虫品种，可减少田间农药施用量30%~50%，降低农业生产成本，减少农药残留与环境污染，符合绿色农业发展与国家粮食安全战略，具备显著的经济、生态与社会效益。