一种融合蛋白MECPP007f及其应用的制作方法

本发明涉及免疫学，具体地说，涉及一种融合蛋白mecpp007f及其应用。

背景技术：

1、结核病（tuberculosis，tb）是由结核分枝杆菌（

mycobacterium tuberculosis，mtb）引起的慢性传染性疾病。随着耐药结核以及hiv合并感染的出现，结核病的控制面临极大的挑战。

2、迄今为止，仅有卡介苗应用于人类预防结核病，虽然卡介苗（bacillus calmetteguerin vaccine，bcg）对儿童结核尤其严重结核的预防有一定的效果，但是对成人结核病的保护效果欠佳（从0~80%不等），因此研发新型安全有效的结核疫苗迫在眉睫。

3、结核新疫苗的研发取得一些进展，最新报告显示目前有16种新型tb疫苗处于临床试验阶段，包括重组蛋白配伍佐剂疫苗（3种）、病毒载体疫苗（4种）、灭活疫苗（5种）、结核分枝杆菌活疫苗（3种）和mrna疫苗（1种）。其中一些候选疫苗在临床研究中取得了一定的进展，在安全性、免疫原性等方面表现一定优势，但是现有疫苗还未能成功获批应用，也没有足够证据能够取代bcg。因此，研究新型有效的结核疫苗仍然迫在眉睫，具有重要意义。

4、结核分枝杆菌h37rv全基因组序列由4.4×106bp，包含约4000多个编码基因，涉及抗原数目较多，因此研发疫苗的关键在于筛选有效的抗原。目前，结核疫苗的抗原主要集中在esat-6、cfp-10、ag85、esx家族和ppe家族等保守分泌抗原和毒力相关抗原。esat-6和cfp-10是结核分枝杆菌中bcg缺失的基因编码的蛋白。esat-6是结核分枝杆菌早期分泌蛋白，含有丰富的t/b表位，具有很强的免疫原性，诱导机体产生有效的免疫应答。cfp-10是从结核分枝杆菌短期培养滤液中分离的一种早期分泌蛋白，它作为结核分枝杆菌重要的t细胞抗原，能够刺激机体早期分泌ifn-γ进而抗结核感染。由于结核分枝杆菌入侵宿主后存在不同的代谢状态（活跃期和休眠期），且在不同代谢状态表达的蛋白抗原存在差异，因此现有技术中已存在将多种抗原蛋白组合使用的方案。

5、然而现有研究虽然选用了多阶段表达的多种抗原，但是制剂中涉及至少两种以上的抗原的表达与纯化，导致制剂配制工艺复杂。而利用原核表达系统表达亚单位疫苗抗原可以降低成本，提高产量，但有些抗原会以包涵体形式表达，蛋白复性过程中会出现蛋白多聚体、沉淀等现象，疫苗表征验证困难、成药性差，因此如何改造优化抗原，保证成药性，也是疫苗研发成功中的关键技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种既可在通过宿主细胞进行融合蛋白制备时，提高重组蛋白复性率，又可提供更佳的免疫性能的融合蛋白。

2、本发明提供了一种融合蛋白mecpp007f，其氨基酸序列如seq id no:4所示。

3、本发明的融合蛋白mecpp007f包含结核分枝杆菌不同代谢状态表达抗原，具体涉及结核分枝杆菌中的4个抗原，分别为早期分泌蛋白抗原rv3875（esat-6）、rv3874（cfp-10）、强t细胞免疫抗原rv0934表位集中区（psts1p）和休眠期的蛋白抗原rv2029c。不同抗原之间使用“gggsgggs”作为连接臂，且包含对原始抗原氨基酸序列的特定调整。该融合蛋白mecpp007f获得了理想的免疫原性，可以显著抑制结核分枝杆菌的生长，且在进行基因重组表达融合蛋白制备时（以含有所述mecpp007f蛋白基因编码序列的重组菌表达重组蛋白），重组蛋白纯化率高、复性率高、多聚体少。

4、本发明还提供编码上述融合蛋白mecpp007f的核苷酸。

5、本发明的核苷酸，其核苷酸序列如seq id no:3所示。

6、本发明还提供一种生物材料，其包含上述核苷酸，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

7、本发明还提供上述融合蛋白mecpp007f或核苷酸或生物材料在制备诊断结核分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染引起疾病的试剂中的应用。

8、结核分枝杆菌感染检测主要的免疫学方法为γ干扰素释放实验（igra）和t-spot，它们均基于检测是否存在结核分枝杆菌的特异性免疫实验，前者需要采用特异性抗原刺激淋巴细胞，检测γ干扰素的含量，以确认是否感染结核分枝杆菌，后者是用特异性抗原刺激淋巴细胞，检测释放γ干扰素的淋巴细胞的数量从而确认是否感染。因此本发明的mecpp007f可以用于后续结核病诊断。

9、本发明还提供上述融合蛋白mecpp007f或核苷酸或生物材料在制备预防结核分枝杆菌感染疫苗中的应用。

10、本发明还提供上述融合蛋白mecpp007f或核苷酸或生物材料在制备治疗结核分枝杆菌感染引起疾病的药物中的应用。

11、本发明还提供一种结核分枝杆菌疫苗，其包括上述融合蛋白mecpp007f和佐剂。

12、本发明还提供一种结核分枝杆菌诊断试剂，其包括上述融合蛋白mecpp007f或核苷酸。

13、本发明还提供上述融合蛋白mecpp007f或核苷酸或生物材料在制备结核dna疫苗和mrna疫苗中的应用。

14、本发明的有益效果至少在于：

15、本发明通过将结核分枝杆菌不同代谢状态时表达的多个特定抗原进行串联，并进行特定改造后融合表达，提供了一种重组蛋白纯化率高、复性率高、多聚体少（为成药性提供了保证）且可保持抗原的空间结构、t/b细胞抗原表位，并具有更佳的免疫性能的融合蛋白。

1.一种融合蛋白mecpp007f，其特征在于，氨基酸序列如seq id no:4所示。

2.编码权利要求1所述的融合蛋白mecpp007f的核苷酸。

3.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，核苷酸序列如seq id no:3所示。

4.一种生物材料，其特征在于，包含权利要求2或3所述的核苷酸，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

5.权利要求1所述的融合蛋白mecpp007f或权利要求2或3所述的核苷酸或权利要求4所述的生物材料在制备诊断结核分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染引起疾病的试剂中的应用。

6.权利要求1所述的融合蛋白mecpp007f或权利要求2或3所述的核苷酸或权利要求4所述的生物材料在制备预防结核分枝杆菌感染疫苗中的应用。

7.权利要求1所述的融合蛋白mecpp007f或权利要求2或3所述的核苷酸或权利要求4所述的生物材料在制备治疗结核分枝杆菌感染引起疾病的药物中的应用。

8.一种结核分枝杆菌疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的融合蛋白mecpp007f和佐剂。

9.一种结核分枝杆菌诊断试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的融合蛋白mecpp007f或权利要求2或3所述的核苷酸。

10.权利要求1所述的融合蛋白mecpp007f或权利要求2或3所述的核苷酸或权利要求4所述的生物材料在制备结核dna疫苗和mrna疫苗中的应用。