适用于多种癌症类型的微肿瘤培养方法、药物筛选方法和药物组合与流程

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种适用于多种癌症类型的微肿瘤培养方法、药物筛选方法和药物组合。

背景技术：

1、免疫检查点阻断（icb）疗法彻底革新了癌症治疗领域，为多种恶性肿瘤患者亚群提供了持久的临床疗效。通过靶向pd-1、pd-l1和 ctla-4等抑制性受体， icb 抗体能重新激活已存在的抗肿瘤t细胞反应，从而实现肿瘤消退。然而，大多数患者无法获益，主要归因于先天或获得性耐药。耐药机制具有多面性，可大致分为肿瘤内在因素和微环境因素两大类。肿瘤内在机制包括抗原呈递缺陷（如mhc i类分子表达缺失）、干扰素-γ信号通路改变，以及抑制t细胞募集的替代致癌级联反应激活（如pi3k、 wnt / β -连环蛋白、 mapk）。在肿瘤微环境（tme）中，细胞毒性t细胞的排斥、免疫抑制细胞（如调节性t细胞、髓源性抑制细胞和m2样巨噬细胞）的积聚，以及替代性免疫检查点（如lag-3、tim-3）的代偿性上调，进一步削弱了有效的抗肿瘤反应。这种复杂性凸显了开发有效联合策略以克服耐药性并扩大 icb治疗效果的迫切需求。

2、为加速新型免疫疗法的发现，能够真实还原人类肿瘤免疫微环境（time）的稳健离体模型至关重要。传统细胞系甚至患者来源的类器官往往无法保留自体免疫区室，这限制了其在免疫肿瘤学研究中的应用价值。尽管近期进展推动了更复杂的离体平台开发——如肿瘤碎片培养、微流控培养、类器官- pbmc 共培养或切片培养等——这些技术能更好地保留天然细胞异质性，但显著局限性依然存在。许多此类系统在标准培养条件下会遭遇快速免疫细胞死亡（尤其是t淋巴细胞），导致功能在数日内丧失。此外，其有限的可扩展性和可重复性常阻碍其在高通量药物筛选中的应用，成为系统性识别协同药物组合的瓶颈。

3、除了维持免疫细胞活性的挑战外，现有的离体平台往往难以深入探究免疫调节的内在机制。对免疫功能至关重要的动态细胞交互作用和空间组织结构，在培养环境中难以维持。因此，这些模型常常无法完整呈现免疫激活的复杂后续效应——包括t细胞的启动、募集、浸润及细胞毒性杀伤——这些效应均与治疗反应相关。这一根本性缺陷不仅阻碍了药物筛选，也妨碍了对免疫反应机制的深入解析，而这些机制对于合理设计下一代免疫疗法至关重要。因此，亟须一种能够同时维持功能性时间窗（time）用于药物评估，并作为解析免疫应答与耐药机制的发现工具的离体平台。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种适用于多种癌症类型的微肿瘤培养（miniaturized-tumor culture，mtc）方法，该方法通过提供优越的微环境，克服传统系统中免疫细胞功能快速衰减的问题，该微环境可在治疗相关的时间范围内维持多种癌症类型自体免疫细胞群（包括t细胞）的存活与功能。其固有的可扩展性直接支持高通量药物筛选，从而系统性地鉴定新型联合疗法。除筛选外， 本发明的方法还作为机制发现的强大工具。通过忠实复现已知的 icb 反应和共培养实验结果，为解析药物作用背后的分子与细胞事件提供了生物学相关背景。

2、例如，利用本发明的方法，不仅鉴定出阿昔替尼（axi）作为抗pd-l1疗法的强效协同剂，还阐明了其通过诱导cxcl13增强抗原呈递和促进t细胞募集的新型作用机制。因此，本发明的方法弥合了高通量药物发现与更深入理解肿瘤微环境中免疫调节之间的鸿沟。

3、同时，本发明还提供了一种药物筛选方法和药物组合。

4、本发明的具体方案为：

5、一种适用于多种癌症类型的微肿瘤培养方法，包括如下步骤：

6、步骤1：将肿瘤组织切割成直径为100~500μm的组织块；

7、步骤2：将组织块置于凝胶中并使凝胶固化；

8、步骤3：将固化后的凝胶与培养基接触，所述凝胶保持和大气接触；

9、培养一段时间后得到具有活力的培养组织。

10、在上述适用于多种癌症类型的微肿瘤培养方法中，所述培养基中还添加有支持t细胞增殖和活化的细胞因子；所述细胞因子为il-2、il-4、il-6、il-7、il-15、 ifnγ 和tnfα中的一种或多种组合。

11、同时，本发明还公开了一种药物筛选方法，所述方法为：

12、采用如上所述的方法培养肿瘤组织，将培养得到的培养组织；使用待测药物处理培养组织，通过免疫检查点阻断方法评估药物反应，进而筛选得到有效药物。

13、最后，本发明还公开了一种药物组合，由第一药物和第二药物组成；所述第一药物为pd-l1抗体；所述第二药物为阿昔替尼、舒尼替尼、达克替尼和达沙替尼、罗格列酮、鲁索替尼、氯苯丁酸、链脲佐菌素、替尼泊苷中的一种或多种。

14、本申请的有益效果是：

15、本发明建立并验证了一个适用于微肿瘤培养平台和方法，该平台和方法展现出优异的自体免疫细胞维持能力及适用于高通量药物筛选的适应性。

16、通过使用小鼠模型和人类患者的肿瘤组织，证实mtc培养可保留自体淋巴细胞群并对免疫检查点阻断（icb）保持应答。与外周血单个核细胞（pbmcs）或脾细胞共培养进一步揭示了 icb 治疗后免疫细胞浸润的增强。此外，源自免疫功能正常和免疫缺陷小鼠模型的mtc 平台均能重现药物反应与耐药表型。

17、在 mtc 模型中进行的药物库筛选鉴定出数种可使肿瘤对抗pd-l1疗法重新敏感的药物，其中阿昔替尼（axi）在不同癌症类型中显示出与抗pd-l1药物最强的协同效应。进一步阐明了axi增强t细胞活化的机制，表明其通过上调cxcl13增强肿瘤细胞和树突状细胞的抗原呈递能力，并提升细胞毒性t细胞功能。

18、总体而言，本发明的研究结果表明， mtc 平台是开发新型抗癌策略及阐明其作用机制的重要工具。

1.一种适用于多种癌症类型的微肿瘤培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的适用于多种癌症类型的微肿瘤培养方法，其特征在于，所述培养基中还添加有支持t细胞增殖和活化的细胞因子；所述细胞因子为il-2、il-4、il-6、il-7、il-15、 ifnγ 和 tnfα中的一种或多种组合。

3.一种药物筛选方法，其特征在于，所述方法为：

4.一种药物组合，其特征在于，由第一药物和第二药物组成；所述第一药物为pd-l1抗体；所述第二药物为阿昔替尼、舒尼替尼、达克替尼和达沙替尼、罗格列酮、鲁索替尼、氯苯丁酸、链脲佐菌素、替尼泊苷中的一种或多种。