一种比活提高的碱性木聚糖酶突变体的制作方法

本发明涉及基因工程和蛋白质工程，具体涉及一种高比活碱性木聚糖酶突变体及其应用。

背景技术：

1、木聚糖（xylan）是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，它占植物碳水化合物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的可再生物质资源。它存在于植物的细胞壁中以及几乎所有部位。

2、木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖或木糖的一类酶的总称。一个木聚糖分子的完全酶解需要几步酶促反应，作用于主链的有两种酶：β-1，4-木聚糖酶（l，4-β-d-xylanohydrolase: ec3.1.2.8）和β-木糖苷酶（1，4-β-d-xylanxylohydrolase:ec3.2.1.37）。一般而言，前者从主链内部作用于木糖苷键，将木聚糖分解成低聚糖，而后者则作用于低聚木糖的末端，释放出木糖。

3、许多微生物可产生木聚糖酶。木聚糖酶的生物化学性质的获得主要来自于细菌和真菌木聚糖酶的研究。细菌所产木聚糖酶可大体分为两类：高分子量的耐酸木聚糖酶，低分子量的耐碱木聚糖酶。但在真菌中却没有这种差别，不过，低分子量木聚糖酶的耐碱性却是共同的。

4、饲料中的木聚糖本身难以被单胃动物消化，同时结合大量的水，使采食动物消化道中食糜的体积增大、粘度增加、养分与消化道内源酶的作用降低，从而阻碍营养物质，尤其是脂肪和蛋白质的消化吸收，降低饲料的利用率。研究结果表明，饲料中如果添加木聚糖酶，就可显著降低阿拉伯木聚糖分子大小，将其分解成较小聚合度的低聚木糖，从而改善饲料性能，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。

5、木聚糖酶可作为生物漂白剂用于造纸工业。木聚糖酶在造纸和纸浆工业中的重要性在于其取代了有毒的化学物质，同时通过酶法预处理可以回收该行业中有用的副产品。其漂白作用在于切开木质素和糖之间的键，松弛纸浆结构。扫描电镜研究显示，用木聚糖酶预处理后的纸浆在纸浆纤维的孔隙上有所提高，有助于其与起漂白作用的化合物的亲和。

6、在葡萄酒和日本大麦烧酒的生产中，已经有了木聚糖酶的应用研究。日本研究人员将耐酸性木聚糖酶xy1c应用于日本大麦烧酒酿造中，结果发现该酶有助于提高发酵效率，增加酒精的产率。

7、木聚糖酶在造纸、食品、能源、饲料以及环境等领域的应用价值，已经得到了肯定，然而由于在天然材料中表达水平低、难以大规模生产、且产物难以纯化以及木聚糖的一些性质不能完全满足应用的要求。随着基因工程技术的发展，通过基因工程这一手段，利用生物反应器提高它的表达量并在分子水平上对木聚糖酶基因进行改造以解决一些木聚糖酶活性（如比酶活、抗逆性、ph值、热稳定性等）的缺陷已成为目前的研究热点。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种高比活碱性木聚糖酶突变体。所述突变体的比活力得到显著提高，有利于降低该酶的生产成本，促进其广泛应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明涉及一种木聚糖酶突变体，其包含与seq id no:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与seq id no:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：7，12，21，23，24，25，26，29，30，31，34，37，38，39，40，41，42，43，44，51，54，91，92，100，102，103，109，118，119，122，123，132，134，141，142，144，145，150，151，152，156，167，168，169，172，173，175，183，184，186。

4、在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。

5、在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。

6、在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：n7s，d12f，t21s，a23g，p24c/g，g25a，t26d，m29/s/v，c30v，l31c/f/n/v，g34a，y37f，s38h/t，t39v/f，q40t，w41f，r42d/h/s，n43s，t44v/s，k51q，a54h/n，v91i，e92d，t100s，t102q，y103t，t109v，e118q/r，t119s/d，y122v/f/t/s，n123d/k/y，t132s，q134n/d，q141s/a/e/f/i/l/m/p/w，q142h/s，r144h/k/q，t145s/p/v，t150n，v151f/s/t，g152d，d156s，s167t，h168n/s/v，d169n，i172v，l173i，t175v，s183d，s184a，v186i。

7、本发明还涉及编码上述木聚糖酶突变体的dna分子。

8、本发明还涉及包含上述dna分子的重组表达质粒。

9、本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达质粒。

10、将上述质粒转入宿主细胞中，重组表达的木聚糖酶突变体的比活力得到显著提升。

11、所述的宿主细胞为毕赤酵母（

pichia pastoris）。

12、所述的宿主细胞为里氏木霉（

trichoderma reesei）。

13、本发明还提供了上述木聚糖酶突变体在造纸领域中的应用。

14、与野生型木聚糖酶mxyl11相比，本发明提供的木聚糖酶单点突变体的比活力均得到显著提高。其中，含t21s单点突变的木聚糖酶突变体的比活力最高，达2322.8 u/mg，是野生型木聚糖酶的两倍，取得了意料不到的技术效果。

15、本发明提供的碱性木聚糖酶突变体的比活力得到显著提高，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域，尤其是造纸领域中的广泛应用。

1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体是氨基酸序列为seq id no:1的木聚糖酶的第142位氨基酸由gln突变为his得到的。

2.编码权利要求1所述木聚糖酶突变体的dna分子。

3.包含权利要求2所述dna分子的重组表达质粒。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求3所述的重组表达质粒。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母（pichia pastoris）。

6.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为里氏木霉（trichoderma reesei）。

7.权利要求1所述木聚糖酶突变体在造纸领域中的应用。