一种鉴别角蝾螺遗传性别的分子标记

本发明属于水产动物分子育种和分子检测，具体地说是一种鉴别角蝾螺遗传性别的分子标记。

背景技术：

1、角蝾螺（turbo cornutus）隶属于软体动物门、腹足纲、原始腹足目、蝾螺科，是我国东南沿海重要的经济贝类之一，具有较高的食用价值和市场认可度。随着天然资源量下降和市场需求的持续增长，角蝾螺的人工养殖规模不断扩大，其苗种繁育和遗传育种工作日益受到重视。

2、性别是水产养殖性状管理中需要关注的重要因素之一。在亲本选配阶段，不同性别亲本的配比直接影响受精效率和苗种产量；在养殖生产阶段，雌雄个体的生长速度、肉质品质和上市规格往往存在差异，性别比例的调控对养殖效益具有直接影响；在遗传育种中，性别决定机制的解析和性别特异性遗传标记的发掘是开展性别控制育种的基础。

3、然而，角蝾螺雌雄个体在外部形态上缺乏稳定可辨的差异，在生殖腺发育成熟之前，仅凭外观特征无法区分性别。目前，角蝾螺的性别确认主要依靠解剖后对性腺进行肉眼观察或组织切片鉴定，这种方法不仅需要处死受检个体，而且要求样本必须达到一定的性成熟度，限制了其在活体亲本筛选和幼体性别鉴定中的应用。

4、目前，尚未见可用于角蝾螺活体遗传性别鉴定的dna分子标记及相关检测方法的报道。因此，获得角蝾螺性别特异的dna分子标记，建立一种不依赖性腺形态观察、可在任意发育阶段对活体个体进行性别鉴定的方法，对于推动角蝾螺养殖产业和遗传育种研究的发展具有重要的实际意义。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供一种鉴别角蝾螺遗传性别的分子标记，以解决现有技术中因角蝾螺雌雄个体缺乏稳定可辨识的外部形态差异，导致仅能依赖解剖性腺或组织切片进行性别确认，从而无法在活体状态下对任意发育阶段的个体实施性别鉴定的问题。

2、本发明提供一种鉴别角蝾螺遗传性别的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no:1所示。

3、本发明还提供一种用于扩增上述分子标记的引物对，所述引物对包括上游引物f1和下游引物r1，所述上游引物f1的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述下游引物r1的核苷酸序列如seq id no:3所示。

4、本发明还提供一种用于鉴别角蝾螺遗传性别的引物组合，所述引物组合包括上述的引物对和内参引物对，所述内参引物对为扩增角蝾螺co1基因片段的引物对，包括上游引物fco和下游引物rco，所述上游引物fco的核苷酸序列如seq id no:4所示，所述下游引物rco的核苷酸序列如seq id no:5所示。

5、本发明还提供一种鉴别角蝾螺遗传性别的多重pcr体系，所述多重pcr体系包括上述的引物组合、2×pcr预混液和无核酸酶水。

6、本发明还提供一种鉴别角蝾螺遗传性别的方法，包括以下步骤：

7、（1）提取待测角蝾螺的基因组dna；

8、（2）以步骤（1）提取的基因组dna为模板，采用上述的引物组合进行多重pcr扩增；

9、（3）对步骤（2）的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

10、（4）根据电泳检测结果判定性别：出现364 bp雌性特异条带且同时出现557 bpco1内参条带的，判定为雌性；仅出现557 bp co1内参条带、未出现364 bp雌性特异条带的，判定为雄性；未出现557 bp co1内参条带的，判定为检测无效。

11、优选的，步骤（1）中所述基因组dna提取自角蝾螺的外套膜组织。

12、优选的，所述外套膜组织的用量为5 mg。

13、优选的，步骤（2）中所述多重pcr扩增的反应体系为：总反应体积20 μl，包含dna模板1 μl、2×pcr预混液10 μl、浓度为10 μm的上游引物f1 0.2 μl、浓度为10 μm的下游引物r1 0.2 μl、浓度为5 μm的上游引物fco 0.2 μl、浓度为5 μm的下游引物rco 0.2 μl、无核酸酶水8.2 μl。

14、优选的，步骤（2）中所述多重pcr扩增的程序为：95℃预变性4 min；95℃变性30 s、54℃退火15 s、72℃延伸10 s，共36个循环；最后72℃延伸4 min。

15、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

16、通过筛选获得角蝾螺雌性特异dna分子标记并设计特异性扩增引物，实现了在dna水平上对遗传性别的直接判定，摆脱了传统方法对个体外部形态特征和性腺发育程度的依赖。该方法在个体发育的任何阶段均可实施，尤其适用于尚未达到性成熟、无法通过性腺观察进行性别鉴定的幼体样本，为角蝾螺的早期性别识别提供了可靠的技术手段。

17、本发明通过将雌性特异标记引物与co1内参引物置于同一反应体系中进行多重pcr扩增，实现了内参对样品处理和扩增过程的有效监控，避免了因dna质量不佳或扩增失败导致的假阴性结果。同时该方法仅需微量活体组织即可完成检测，取样后个体可继续存活和养殖，不影响后续育种和生产的正常进行，相比传统的性腺解剖或组织切片法显著减少了对受检个体的损伤。

18、本发明所建立的检测方法基于常规多重pcr和琼脂糖凝胶电泳技术，涉及的仪器设备和试剂均为分子生物学实验室的常规配置，无需特殊仪器或昂贵耗材，便于在各层级科研单位和育苗生产场站推广应用。该方法操作流程简便、结果判读直观，可用于苗种培育过程中的性别筛选、亲本选配时的性别确认以及养殖群体性别比例的调控管理，具有良好的实用推广前景。

1.一种鉴别角蝾螺遗传性别的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no:1所示。

2.一种用于扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物f1和下游引物r1，所述上游引物f1的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述下游引物r1的核苷酸序列如seq id no:3所示。

3.一种用于鉴别角蝾螺遗传性别的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括权利要求2所述的引物对和内参引物对，所述内参引物对为扩增角蝾螺co1基因片段的引物对，包括上游引物fco和下游引物rco，所述上游引物fco的核苷酸序列如seq id no:4所示，所述下游引物rco的核苷酸序列如seq id no:5所示。

4.一种鉴别角蝾螺遗传性别的多重pcr体系，其特征在于，所述多重pcr体系包括权利要求3所述的引物组合、2×pcr预混液和无核酸酶水。

5.一种鉴别角蝾螺遗传性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述基因组dna提取自角蝾螺的外套膜组织。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述外套膜组织的用量为5 mg。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述多重pcr扩增的反应体系为：总反应体积20 μl，包含dna模板1 μl、2×pcr预混液10 μl、浓度为10 μm的上游引物f10.2 μl、浓度为10 μm的下游引物r1 0.2 μl、浓度为5 μm的上游引物fco 0.2 μl、浓度为5μm的下游引物rco 0.2 μl、无核酸酶水8.2 μl。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述多重pcr扩增的程序为：95℃预变性4 min；95℃变性30 s、54℃退火15 s、72℃延伸10 s，共36个循环；最后72℃延伸4min。

10.权利要求1所述分子标记、权利要求2所述引物对、权利要求3所述引物组合或权利要求4所述多重pcr体系在角蝾螺遗传性别鉴定中的应用。