一种糖苷酶和蛋白酶联用提取微生物团聚体中胞外DNA的方法

本发明属于环境dna提取，具体涉及一种糖苷酶和蛋白酶联用提取微生物团聚体中胞外dna的方法。

背景技术：

1、环境dna（environmental dna，简称edna），包括胞内dna（intracellular dna，简称idna）和胞外dna（extracellular dna，简称exdna），是记录微生物群落特征及其演化的宝贵档案，尤其在水生环境中。环境dna同时携带着大量遗传信息，例如抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes, args），对公共健康构成重大风险。相当一部分exdna与普遍存在的水生微生物聚集体（aquatic microbial aggregates, amas）紧密结合，而非在环境中游离存在。这意味着exdna常与idna混合，尤其是在采用0.22 μm滤膜进行二者分离时，重叠现象尤为突出，给exdna的高效提取带来了重大挑战，进而影响了水生环境中idna和exdna微生物组分析的准确性。

2、现有的胞外dna分离与提取方案（如化学处理法、蛋白酶水解法等）在在处理结构致密的水生微生物聚集体时均存在明显不足。传统化学法采用磷酸盐缓冲液作为化学竞争剂，试图通过阴离子桥吸附竞争来释放exdna，但受限于化学分散剂的空间位阻渗透缺陷，实际效果有限。纳米红外成像等研究表明，exdna在三维空间上主要与高度分支的长链胞外多糖骨架交织在一起。这种致密的多糖网络产生了巨大的空间位阻，外源化学试剂难以渗透并接触到包裹于网络内部深层的紧密结合态exdna，导致提取效率极低。

3、在酶解方案方面，目前应用最广泛的方法是依赖胰蛋白酶或蛋白酶k，然而蛋白酶仅能使外围蛋白结构部分松散，令聚集体呈现多孔形态，但无法切断胞外多糖的主链与分支连接，胞外多糖网络与exdna之间的紧密空间交织和物理束缚依然存在，因此单靠蛋白酶解在释放紧密结合态exdna方面效果十分有限。

4、因此，亟需一种能够同步切割微生物团聚体中多糖主链、分支连接以及蛋白链的方法，以彻底破坏多糖和蛋白骨架对exdna的束缚，从而实现与多糖和蛋白骨架交织杂糅的exdna的高效提取。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有技术中的不足，并提供一种糖苷酶和蛋白酶联用提取微生物团聚体中胞外dna的方法。

2、本发明所采用的具体技术方案如下：

3、本发明提供一种糖苷酶和蛋白酶联用提取微生物团聚体中胞外dna的方法，具体如下：

4、s1：采用螯合剂对含有微生物团聚体的待提取样本进行前处理，初步瓦解微生物团聚体中的离子桥联作用；

5、s2：向经过前处理的样本中加入蛋白酶，进行酶解反应以破坏所述微生物团聚体中的蛋白骨架；酶解反应终止后采用滤膜进行第一次过滤分离，分别获得含有胞外dna的一次分离滤液和膜上残留物；

6、s3：采用糖苷酶处理步骤s2中获得的膜上残留物，以切断所述微生物团聚体中多糖骨架的主链和分支连接；反应结束后，采用新的滤膜进行第二次过滤分离，保留含有胞外dna的二次分离滤液；

7、s4：将一次分离滤液和二次分离滤液合并后浓缩，从浓缩滤液中提取胞外dna。

8、作为优选，步骤s1中所述螯合剂采用乙二胺四乙酸或焦磷酸钠的缓冲溶液。

9、作为优选，步骤s1中所述螯合剂的浓度为5~10 mm，前处理反应时间为3~10分钟。

10、作为优选，步骤s2中所述蛋白酶采用胰蛋白酶或蛋白酶k。

11、作为优选，步骤s2中所述蛋白酶的终浓度为1~2.5 mg/ml；所述酶解反应的时间为5~15分钟。

12、作为优选，步骤s3中所述糖苷酶采用α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、糖基肽酶f或普鲁兰酶中的一种或多种组合。

13、作为优选，步骤s3中所述糖苷酶的总酶活浓度范围控制在500~2000 u/ml。

14、作为优选，步骤s3中所述糖苷酶处理温度为40℃~60℃，处理时间为20~40分钟。

15、作为优选，步骤s2和步骤s3中所述滤膜采用直径为0.22 μm的聚碳酸酯膜。

16、作为优选，步骤s4中采用游离dna提取试剂盒提取胞外dna。

17、本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：

18、（1）本发明采用糖苷酶和蛋白酶联合处理，通过切割微生物团聚体中多糖主链、分支连接以及蛋白链，彻底破坏多糖和蛋白骨架对胞外dna的束缚，将致密的微生物团聚体结构转化为疏松状态，从而充分释放其中交织杂糅的胞外dna。实验数据表明，相较于仅使用蛋白酶的传统方法，本发明可将胞外dna提取产量最高提高至97.6%。

19、（2）本发明通过两次过滤分离与滤液合并的操作，确保胞内dna与胞外dna的有效分离，避免了胞内dna的污染干扰。本发明不会造成显著的胞内dna泄漏，也不干扰胞外dna的片段长度分布，保障了下游分子生物学分析的准确性和可重复性。

20、（3）本发明采用酶解法替代物理破碎或强化学裂解手段，无需复杂设备，反应条件温和，且所用糖苷酶和蛋白酶均为商业化常规酶制剂，成本可控，易于在常规分子生物学实验室推广实施，适合大批量环境样本的日常监测与分析。

1.一种糖苷酶和蛋白酶联用提取微生物团聚体中胞外dna的方法，其特征在于，具体如下：

2.根据权利要求1所述的糖苷酶和蛋白酶联用提取微生物团聚体中胞外dna的方法，其特征在于，步骤s1中所述螯合剂采用乙二胺四乙酸或焦磷酸钠的缓冲溶液。

3.根据权利要求1所述的糖苷酶和蛋白酶联用提取微生物团聚体中胞外dna的方法，其特征在于，步骤s1中所述螯合剂的浓度为5~10 mm，前处理反应时间为3~10分钟。

4.根据权利要求1所述的糖苷酶和蛋白酶联用提取微生物团聚体中胞外dna的方法，其特征在于，步骤s2中所述蛋白酶采用胰蛋白酶或蛋白酶k。

5.根据权利要求1所述的糖苷酶和蛋白酶联用提取微生物团聚体中胞外dna的方法，其特征在于，步骤s2中所述蛋白酶的终浓度为1~2.5 mg/ml；所述酶解反应的时间为5~15分钟。

6.根据权利要求1所述的糖苷酶和蛋白酶联用提取微生物团聚体中胞外dna的方法，其特征在于，步骤s3中所述糖苷酶采用α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、糖基肽酶f或普鲁兰酶中的一种或多种组合。

7.根据权利要求1所述的糖苷酶和蛋白酶联用提取微生物团聚体中胞外dna的方法，其特征在于，步骤s3中所述糖苷酶的总酶活浓度范围控制在500~2000 u/ml。

8.根据权利要求1所述的糖苷酶和蛋白酶联用提取微生物团聚体中胞外dna的方法，其特征在于，步骤s3中所述糖苷酶处理温度为40℃~60℃，处理时间为20~40分钟。

9.根据权利要求1所述的糖苷酶和蛋白酶联用提取微生物团聚体中胞外dna的方法，其特征在于，步骤s2和步骤s3中所述滤膜采用直径为0.22 μm的聚碳酸酯膜。

10.根据权利要求1所述的糖苷酶和蛋白酶联用提取微生物团聚体中胞外dna的方法，其特征在于，步骤s4中采用游离dna提取试剂盒提取胞外dna。