一种高纯度胆红素Ⅸα的纯化方法与流程

本发明属于胆红素纯化领域，具体涉及一种以低纯度胆红素为原料联合液相色谱技术制备高纯度胆红素ⅸα的方法。

背景技术：

1、胆红素（bilirubin, br）是分析化学及生化研究的重要试剂和贵重的生化药品，同时也是许多药物的主要原料。目前，国内制备胆红素主要以两种途径为主：一种途径是以动物胆汁为原料，通过钙盐法、醋酸法、直接快速法等方法提取胆汁中的胆红素，但在提取过程天然胆红素易受酸碱的影响，使得双吡咯环发生异构化，因此，提取出的胆红素中除ⅸα主成分外，还含有不同量的ⅲα、xⅲα两种异构体；另一种途径是以动物血液（或血红蛋白、血红素）为原料，通过氧化还原转化获得胆绿素ⅸ的四种异构体，然后再用硼氢化钠还原胆绿素得到相应结构的胆红素，所以，合成的胆红素除含有ⅸα有效成分外，还有ixβ、ixγ、ixδ三种异构体。

2、天然胆红素的主要成分以及动物体内代谢产物的主要产物均是胆红素ⅸα，胆红素ⅸα具有广泛的生理活性，在机体内发挥着抗氧化、抗凋亡、免疫调节等作用，因此，得到高纯度的单一结构胆红素ⅸα有利于深入研究胆红素的药用机理，发挥胆红素的医用价值。另一方面，研究机构已单独将胆红素产品中的胆红素ⅸα含量作为重要指标，要求异构体ⅲα和xⅲα之和小于10%，因此，提取到的低含量胆红素ⅸα必须进一步的精制纯化后方可达到使用要求。

3、由于上述制备工艺产生的胆红素ⅸα含有大量的杂质，其中包括胆红素异构体杂质（ⅲα、xⅲα、ixβ、ixγ、ixδ），而这些异构体杂质难以分离出。截止目前，国内外在胆红素提纯方面，主要是利用胆红素易溶于氯仿的特性，用氯仿多次萃取提纯。但此类方法所需溶剂量高，环境处理成本高，异构体不易去除，操作过程中胆红素ⅸα易受氧、光、热等影响发生异构、产生杂质、导致含量降低，而在此基础上进行的技术改进（如分级溶解、液液萃取、溶析结晶等），也难以使胆红素ⅸα纯度达到97%以上。液相色谱法虽然是较优的提纯技术，但国内外采用液相色谱分离制备胆红素的报道较少，停留在分析和实验室中少量样品的分离，处理量基本是1~10毫克级，工业化生产尚未见报道。另外，超临界流体萃取技术已在食品、医药、石油化工等领域广泛应用，但该项技术在分离纯化特别是胆红素中的应用仍需进一步拓展。

4、为更好鉴定分离后的提取效果，本发明还提供了一种hplc检测方法。

5、因此，亟需要开发一种高效、具有工业化生产潜力的联合液相色谱技术制备出高纯度胆红素ⅸα，并能对其效果进行准确科学评价的方法。

技术实现思路

1、基于此，针对现有技术的不足之处，本发明提供了一种联合液相色谱分离技术纯化胆红素的方法，制备出纯度高、收率高的胆红素ⅸα；产品既可以作为分析检测的标准品，也可作为高端医药原料使用，且制备工艺简单、周期短、适于规模化生产。

2、本发明的技术方案包括如下：

3、一种高纯度胆红素ⅸα的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

4、1）初步纯化：将胆红素原料用溶剂a混合溶解，升温至25℃~35℃后，加入活性炭，保温搅拌30min~45min后，过滤，向滤液中滴加纯化水，直至晶体析出，离心，获得含有胆红素及其异构体的初纯物；

5、2）分离纯化：将步骤1）中制备的初纯物用溶剂b溶解后，采用制备液相色谱分离出胆红素ⅸα及其异构体，收集相对应的洗脱液；

6、3）结晶干燥：将步骤2）中收集的胆红素ⅸα洗脱液采用超临界流体进行重结晶干燥，得到胆红素ⅸα固体产品；

7、4）含量测定：将胆红素产品用溶剂c溶解后，采用分析液相色谱进行检测，计算含量。

8、进一步地，胆红素原料其含量为90%左右；胆红素异构体包括ixβ、ixγ、ixδ、ⅲα、xⅲα。

9、进一步地，步骤1）中溶剂a为三氯甲烷与二甲基亚砜的混合溶液，三氯甲烷与二甲基亚砜的体积比为1：5；溶剂a与胆红素原料的质量比为（90~110）l：（0.5~1）kg。

10、进一步地，步骤1）中的活性炭与胆红素原料的质量比为2%~3%：1；纯化水与溶剂a的体积比为3~4：1，滴加纯化水的时间为0.5h~1h。

11、进一步地，步骤2）中的溶剂b为三氯甲烷与二甲基亚砜的混合溶液，三氯甲烷与二甲基亚砜的体积比为（7~9）：1；溶剂b与初纯物的质量比为1l：（20~25）g。

12、进一步地，步骤2）中的制备条件为：c18柱（填料粒径为40μm~50μm、内径40cm~50cm、柱长240cm~300cm）；洗脱液为甲醇-乙腈-1%~2%冰醋酸（80~88：10：2~10）；洗脱流速为150ml/min~180ml/min；柱温40℃~50℃；检测波长为450nm；进样量700ml/次~750ml/次。

13、进一步地，步骤3）中的结晶干燥条件为：温度40℃~50℃；压力为15.0mpa~20.0mpa；时间为2h~2.5h；co2流量为20kg/h~25kg/h。

14、进一步地，步骤4）中所述的溶剂c为三氯甲烷；溶剂c与胆红素产品的质量比为1ml：0.1mg。

15、进一步地，步骤4）中的分析条件为：色谱柱为c18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-二甲基亚砜-0.5%~1%醋酸铵溶液（1：1.4~1.5：1~1.2）；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为450nm；进样量为10μl。

16、进一步地，所制备的胆红素固体产品纯度可达99.8%，产率和胆红素ⅸα含量分别可达84%及97%以上。

17、本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

18、（1）本发明利用活性炭的吸附作用去除胆红素中可吸附性的杂质，然后采用溶析结晶技术，利用胆红素各异构体在三氯甲烷-二甲基亚砜相和水相两个体系中不同的溶解度，将少量水溶性杂质及胆红素异构体从胆红素产品中分离出去，从而提高胆红素ⅸα含量，达到初步纯化胆红素的目的。

19、（2）本发明采用制备液相色谱的分离技术，实现胆红素ⅸα与异构体有效分离，使得产品纯度进一步提高，并可根据需要从中获得各种异构体。

20、（3）本发明利用超临界流体技术实现结晶干燥，去除了产品中残留的脂质杂质，有效降低了浓缩干燥带来的异构风险，再次提高了胆红素含量ⅸα含量，同时减少了三氯甲烷大量使用带来的环境污染。

21、（4）本发明操作方便，适合规模化生产，为工业化生产提供了重要的工艺参数，填补了用制备液相色谱大量制备高纯度胆红素的技术空缺，制备出的产品纯度达99.8%，胆红素ⅸα含量达97%以上，不仅能够作为分析检测的标准品，又能满足高端医药原料的需求，有利于发挥胆红素的医用价值，提高市场竞争力。

1.一种高纯度胆红素ⅸα的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种高纯度胆红素ⅸα的纯化方法，其特征在于，所述的胆红素原料其含量为90%左右；所述的异构体包括ixβ、ixγ、ixδ、ⅲα、xⅲα。

3.根据权利要求1所述的一种高纯度胆红素ⅸα的纯化方法，其特征在于，步骤s1中所述的溶剂a为三氯甲烷与二甲基亚砜的混合溶液，三氯甲烷与二甲基亚砜的体积比为1：5；所述溶剂a与胆红素原料的质量比为（90~110）l：（0.5~1）kg；所述的活性炭与胆红素原料的质量比为2%~3%：1；所述的纯化水与溶剂a的体积比为3~4：1，滴加纯化水的时间为0.5h~1h。

4.根据权利要求1所述的一种高纯度胆红素ⅸα的纯化方法，其特征在于，步骤s2中所述的溶剂b为三氯甲烷与二甲基亚砜的混合溶液，三氯甲烷与二甲基亚砜的体积比为（7~9）：1；所述溶剂b与初纯物的质量比为1l：（20~25）g。

5.根据权利要求1所述的一种高纯度胆红素ⅸα的纯化方法，其特征在于，步骤s2中的制备条件为：c18柱（填料粒径为40μm~50μm、内径40cm~50cm、柱长240cm~300cm）；洗脱液为甲醇-乙腈-1%~2%冰醋酸（80~88：10：2~10）；洗脱流速为150ml/min~180ml/min；柱温40℃~50℃；检测波长为450nm；进样量700ml/次~750ml/次。

6.根据权利要求1所述的一种高纯度胆红素ⅸα的纯化方法，其特征在于，步骤s3中的结晶干燥条件为：温度40℃~50℃；压力为15.0mpa~20.0mpa；时间为2h~2.5h；co2流量为20kg/h~25kg/h。

7.根据权利要求1所述的一种高纯度胆红素ⅸα的纯化方法，其特征在于，步骤s4中所述的溶剂c为三氯甲烷；所述溶剂c与胆红素产品的质量比为1ml：0.1mg。

8.根据权利要求1所述的一种高纯度胆红素ⅸα的纯化方法，其特征在于，步骤s4中的分析条件为：色谱柱为c18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-二甲基亚砜-0.5%~1%醋酸铵溶液（1：1.4~1.5：1~1.2）；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为450nm；进样量为10μl。

9.根据权利要求1所述的一种高纯度胆红素ⅸα的纯化方法，其特征在于，所制备的胆红素固体产品纯度可达99.8%，产率和胆红素ⅸα含量分别可达84%及97%以上。