一种猪轮状病毒的高纯度纯化方法及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种猪轮状病毒的高纯度纯化方法及其应用。

背景技术：

1、猪轮状病毒（porcine rotavirus, porv）隶属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，其基因组由11个节段的双链rna组成，编码6种结构蛋白和5-6种非结构蛋白。该病毒是引发仔猪急性肠道传染病的核心病原，主要侵害8周龄内仔猪，呈现显著的冬季高发特征，成年猪多呈隐性感染。临床以消化道功能紊乱为核心表现，病猪出现水样腹泻、呕吐及严重脱水等症状，初生仔猪感染后死亡率极高。目前尚无针对该病的特效治疗药物，防控体系主要依赖疫苗免疫与对症支持疗法，现有疫苗类型涵盖三联活疫苗、灭活苗等。无论是疫苗研发、质控评价，还是基础病毒学研究，均离不开高纯度、高活性病毒颗粒的制备，因此病毒纯化成为相关研究的关键前置环节。

2、病毒纯化是指从复杂的生物样本中分离出目标病毒颗粒，同时尽可能去除宿主细胞成分、杂蛋白、核酸碎片等杂质，并兼顾病毒回收率与感染性及结构完整性的过程。目前，实验室及工业生产中常用的病毒纯化方法包括差速离心法、密度梯度离心法、超速离心法、聚乙二醇（peg）沉淀法、层析法以及过滤法等。然而，这些传统方法在实际应用中普遍存在诸多局限：一方面，纯化产物纯度往往不足，仍残留较多宿主细胞蛋白、游离核酸及培养基成分，难以满足高精度研究或高质量疫苗生产的要求；另一方面，多数方法依赖超速离心机、层析系统等昂贵设备，且操作流程复杂、对专业技术人员要求高、耗时较长，导致纯化成本高昂，不适合一般实验室开展少量病毒的高效纯化工作。

3、针对猪轮状病毒的特性，传统纯化方法的局限性更为突出。其无囊膜、二十面体对称的结构虽具备一定环境稳定性，但在纯化过程中仍易因机械剪切、渗透压波动或化学试剂作用发生聚集、破损或失活。例如，peg沉淀法虽操作简便，但共沉淀杂质多，后续除杂难度大；蔗糖或氯化铯密度梯度离心法虽可获得较高纯度，但步骤繁杂、离心时间长，且高浓度溶质可能损伤病毒颗粒；层析法适配规模化生产，但介质成本高、方法开发周期长，无法满足小量样品的快速纯化需求。

4、因此，亟需开发一种操作简单、无需特殊昂贵仪器、适配一般实验室条件，且能在保障病毒完整性与感染性的前提下实现高纯度分离的猪轮状病毒纯化新方法，以填补现有技术在小量病毒高效纯化领域的空白。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术的不足，本发明提供了一种猪轮状病毒的高纯度纯化方法及其应用，通过采用“小肽辅助培养+双电泳孔内回收+超滤换液”的工艺，在温和条件下实现了少量猪轮状病毒的高效、高纯度分离，有效解决了现有技术中纯度不足、操作复杂、成本高昂及病毒易失活等技术难题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种猪轮状病毒的高纯度纯化方法，包括以下步骤：

4、s1.病毒增殖：在基础培养基中加入分子量小于1k da的氨基酸小肽溶液进行细胞培养，接种猪轮状病毒，待病毒充分繁殖后收集细胞培养上清液，低速离心去除细胞碎片，收集细胞培养上清液；

5、s2.第一次超滤浓缩：将步骤s1中的上清液加入截留分子量为10~150k的超滤管中进行离心浓缩，获得病毒浓缩液；

6、s3.非变性page回收：将步骤s2的病毒浓缩液进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（page），电泳结束后不染色，直接吸取上样孔内残留液体，获得病毒粗纯液；

7、s4.核酸电泳回收：将步骤s3的病毒粗纯液进行琼脂糖凝胶电泳，所述琼脂糖凝胶的上样孔预先经琼脂糖溶液封闭，电泳结束后不染色，直接吸取上样孔内残留液体，获得病毒精纯液；

8、s5.第二次超滤换液：将步骤s4的病毒精纯液加入截留分子量为10~150k的超滤管行超滤换液，收集截留液，即为高纯度猪轮状病毒。

9、进一步的，步骤s1中，所述基础培养基为dmem培养基（杜尔贝科改良伊格尔培养基），且所述培养基中不添加胎牛血清或仅添加透析过的血清；所述氨基酸小肽在基础培养基中的终浓度为1~10mg/ml；进一步优选为1mg/ml、5mg/ml或10mg/ml。该浓度范围的小肽可在病毒增殖阶段调节培养环境，减少宿主蛋白的非特异性分泌，从源头降低杂质负荷，同时不影响病毒的感染性与结构完整性。

10、进一步的，步骤s2中，所述离心浓缩的条件为：转速4000~6000rpm，时间30~60min；所述浓缩倍数为20~50倍。该参数组合可在避免病毒颗粒机械损伤的前提下，高效去除培养基中的小分子杂质，为后续电泳纯化提供适宜的样品浓度。

11、进一步的，步骤s3中，所述非变性page电泳的凝胶浓度为4%~8%，电泳电压为80v，电泳时间为90min。该条件下，完整病毒颗粒因粒径远大于凝胶孔径而滞留在上样孔内，而大部分宿主蛋白可进入分离胶被分离，实现基于粒径的初步纯化；不染色操作避免了染料结合或固定剂对病毒的损伤，保障了回收病毒的活性。

12、进一步的，步骤s4中，所述琼脂糖凝胶的浓度为0.5%~1%，电泳电压为120v，电泳时间为50~60min。所述上样孔封闭操作可防止样品在电泳过程中从孔底渗漏流失，确保微量病毒样品的完全回收；该步骤利用核酸电泳体系进一步分离与病毒颗粒大小相近的核酸-蛋白复合物，弥补上述非变性page对核酸杂质去除能力的不足。

13、进一步的，步骤s5中，所述pbs缓冲液的浓度为1mm，ph为7.2~7.4；所述换液次数为2~3次。

14、当步骤s1中小肽终浓度为1mg/ml或5mg/ml时，第二次超滤换液时可选用截留分子量为30k的超滤管；当小肽终浓度为10mg/ml时，可选用截留分子量为100k的超滤管，在保证病毒截留率的同时最大限度去除残留小肽及盐离子。

15、本发明还提供了一种高纯度猪轮状病毒，其由上述所述的纯化方法制备得到。

16、进一步的，所述高纯度猪轮状病毒的总蛋白浓度为1~3mg/ml。

17、本发明还提供了上述所述的猪轮状病毒纯化方法在制备高纯度猪轮状病毒疫苗抗原、诊断试剂用标准品或细胞感染实验用病毒种子液中的应用。

18、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

19、（1）纯度高、杂质去除彻底：本发明通过“非变性page+核酸电泳”双重孔内回收机制，分别基于蛋白质粒径和核酸电荷特性逐级去除宿主蛋白、游离核酸及小分子杂质，最终产物经电泳验证无可见杂带，纯度显著优于传统peg沉淀法及差速离心法。

20、（2）病毒完整性与活性保持良好：本发明全程采用非变性条件，避免染色、有机溶剂沉淀、高密度溶质及长时间超速离心等损伤性操作；小肽辅助培养从源头改善病毒质量，双重电泳孔内回收减少病毒暴露于不利环境的时间，保障了病毒颗粒的结构完整性和感染性。

21、（3）操作简便、成本低廉、普适性强：本发明仅需常规台式离心机、电泳仪及超滤管即可完成全部操作；流程标准化程度高，对操作人员技术要求低，特别适合一般实验室开展少量病毒样品的快速纯化，填补了小量猪轮状病毒高效纯化的技术空白。

22、（4）参数协同、适配性广：本发明小肽浓度、电泳条件与超滤孔径形成协同优化的参数体系，可根据不同实验需求灵活调整，兼顾低背景样品的高回收率与高杂质样品的深度纯化，具有良好的应用扩展性。