一种超声响应型压电Janus骨再生复合膜及其制备方法和应用

本发明涉及生物医用材料与组织工程，尤其涉及一种超声响应型压电janus骨再生复合膜及其制备方法和应用。

背景技术：

1、引导骨再生术（gbr）是牙科种植及颌面外科领域的一项金标准技术。其核心生物学原理是利用屏障膜阻挡迁移速度较快的上皮细胞和成纤维细胞长入缺损区，从而为迁移较慢的成骨祖细胞创造一个相对封闭的、受保护的再生空间[1]。目前，以bio-gide®为代表的天然胶原膜因其优异的生物相容性和适宜的降解速率，已成为临床主流。然而，此类膜本质上仅作为一种“被动物理屏障”发挥作用。在复杂的临床病例（如大型骨缺损、糖尿病患者或伴有牙周炎的缺损）中，缺损微环境通常处于高氧化应激（ros过量）、持续性炎症、缺血缺氧及细菌定植的病理状态。被动屏障膜无法主动调节这一恶劣微环境，导致膜过早降解、伤口裂开或骨再生失败。

2、为了克服上述局限，研究者开发了第二代“生物活性”膜。常见的策略包括负载生长因子（如bmp-2）、抗生素或无机活性离子（如锶、镁）。尽管这些方法在一定程度上促进了骨愈合，但仍面临严峻挑战：（1）安全性与成本：生长因子通常需要超生理剂量才能生效，这不仅成本高昂，还可能引发异位成骨、严重肿胀甚至致癌风险；（2）释放动力学失控：简单的物理吸附往往导致药物“突释效应”（burst release），无法匹配骨再生长达数周至数月的生理周期；（3）功能单一性：多数改性膜仅关注单一靶点（如仅抗菌或仅促成骨），缺乏对愈合全过程的系统性协调。

3、一个关键但尚未得到充分利用的生物学原理是生物电信号在骨愈合过程中的作用。骨是一种天然的压电材料；机械应力会产生电位，这是骨重塑和修复的关键调节因素。这一发现推动了压电聚合物（如聚左旋乳酸，plla）在骨支架中的应用。然而，传统的压电支架存在显著的转化瓶颈：plla的压电系数较低，且通常依赖植入体受到的直接机械载荷（如行走、咀嚼）来产生电信号。在口腔颌面部或早期愈合阶段，施加直接机械载荷是不切实际甚至有害的。因此，如何实现“非侵入性、可远程控制”的电刺激（如通过超声波触发）成为当前的研究热点。

4、现代骨组织工程学已从单纯关注成骨细胞转向“骨免疫调节”。研究表明，巨噬细胞从促炎（m1）向抑炎/修复（m2）表型的及时转化是骨再生的先决条件。同时，利用特异性适配体招募内源性干细胞已成为替代外源性细胞移植的前沿策略。然而，现有技术存在一个未被解决的“募集-生存悖论”：如果微环境中的氧化应激（ros）和炎症未得到清除，盲目招募来的干细胞将面临“招募即凋亡”的命运，无法有效分化。因此，迫切需要一种能够同步解决“恶劣微环境重塑（抗氧化/免疫调节）”、“干细胞有效募集与保护”以及“远程物理刺激（压电成骨）”的集成化智能屏障膜。

技术实现思路

1、为了克服现有商业化膜（如胶原膜）无法协同调控物理与生化微环境的问题，本发明提供一种超声响应型压电janus骨再生复合膜及其制备方法和应用，该复合膜不仅能提供优异的防粘连物理屏障与力学支撑，更能通过超声介导的压电效应、靶向适配体的高效募集以及抗氧化/抗菌高分子网络的协同作用，实现复杂骨缺损微环境的主动重塑与高质量骨组织再生。

2、本发明是通过以下技术方案予以实现的：

3、本发明的第一个目的是提供一种超声响应型压电janus骨再生复合膜，包括依次设置的a面和b面，所述的a面为压电纳米复合薄膜层，b面为生物活性水凝胶层；所述的压电纳米复合薄膜层包括疏水性高分子聚合物和均匀分散于疏水性高分子聚合物中的压电纳米材料；所述的生物活性水凝胶层包括胶原蛋白、含没食子酸和光交联基团的 pgm 聚合物以及通过席夫碱键接枝的干细胞靶向适配体，所述的生物活性水凝胶层部分渗入压电纳米复合薄膜层的孔隙中并原位交联，形成物理互锁结构。

4、优选地，所述的压电纳米复合薄膜层为经过静电纺丝制备的聚（l-乳酸）（plla）/钛酸钡（bto）梯度复合薄膜层。

5、本发明提出的复合膜是具有双面异质（janus）结构的超声响应型复合膜，a面（软组织侧）是利用静电纺丝技术构建plla/bto压电纳米纤维层，旨在提供致密的物理屏障以阻挡软组织长入，同时具备压电活性；b面（骨缺损侧）利用胶原蛋白、适配体（apt19s）及功能化聚合物（pgm）构建生物活性水凝胶层。本发明将“物理屏障”、“压电刺激”、“抗氧化/抗菌保护”与“干细胞靶向招募”四大核心功能集成于单一的janus体系中，协同调控物理与生化微环境。

6、优选地，所述的压电纳米复合薄膜层厚度为0.1~0.5 mm，所述的生物活性水凝胶层的厚度为0.5~1.2 mm。

7、本发明的第二个目的是提供所述的超声响应型压电janus骨再生复合膜的制备方法，包括如下步骤：

8、s1、利用静电纺丝制备压电纳米复合薄膜层；

9、s2、合成含没食子酸和光交联基团的 pgm 聚合物；

10、s3、将胶原蛋白、步骤s2得到的pgm聚合物和醛基修饰的干细胞靶向适配体混合形成生物活性水凝胶前驱液；

11、s4、将步骤s3得到的生物活性水凝胶前驱液涂布于压电纳米复合薄膜层表面，使其渗入压电纳米复合薄膜层的孔隙，通过温度诱导胶原自组装，随后进行光照交联固化，并同时完成适配体的席夫碱共价接枝，得到所述的超声响应型压电janus骨再生复合膜。

12、本发明提出的通过温度诱导胶原自组装指37℃的生理恒温环境同步触发胶原蛋白分子的热诱导物理自组装。

13、本发明提出的制备方法得到的超声响应型纳米纤维-水凝胶压电janus骨再生复合膜，通过物理信号与生物化学信号的深度整合，解决了现有引导骨再生（gbr）膜功能被动、微环境适配性差等问题。其具体优点如下：

14、1、结构创新：物理互锁的非对称 janus 界面设计打破了传统单层 gbr 膜的局限，构建了“外层疏水屏障（防软组织侵入）+ 内层亲水促黏附（仿生细胞外基质）”的非对称结构。通过前驱液浸润与原位光交联，在两层之间形成了微米级的“纤维-水凝胶”物理互锁结构，解决了传统复合膜在湿态下易层间剥离的业界难题。

15、2、“刚柔并济”的力学适配与非对称界面：janus 结构实现了外侧疏水防粘连（水接触角约 135°）与内侧亲水促黏附（水接触角约 75°）。压电纤维层赋予材料卓越的抗拉强度（杨氏模量达 192 mpa，远超 bio-gide 的 17 mpa），而水凝胶层提供类似天然肉芽组织的低模量微环境（压缩模量 11.5 kpa），避免了对新生组织的机械剪切损伤。

16、3、超声响应的智能控释与压电成骨：复合膜具有优异的压电活性（d33 = 23.2）。外部超声（us）触发产生的压电微电场不仅模拟了骨组织天然生物电，还加速了动态亚胺键的水解，实现了 apt-19s 适配体的按需释放（14天累积释放率提升至 80%）。

17、4、干细胞的精准靶向募集：apt-19s 适配体对牙周膜干细胞（pdlscs）展现出极高的靶向结合率（96.4%）。“生化锚定+压电电场”的协同作用深度激活了 sdf-1α/cxcr4 趋化信号轴，显著促进了干细胞的早期铺展与跨膜迁移。

18、5、强效的微环境重塑（抗氧化、抗菌与免疫调节）：pgm 聚合物网络赋予材料高效的接触式杀菌能力（杀菌率>80%）及优异的自由基清除率（约 85%）。在极端氧化应激下，该复合膜能有效清除胞内 ros，保护干细胞线粒体结构完整，使细胞存活与增殖率100%恢复至健康水平；同时显著促使巨噬细胞向促修复的 m2 型极化，并协同超声大幅上调 vegf表达，实现“免疫-血管”耦合。

19、6、体内骨修复全面超越临床金标准：在大鼠临界尺寸颅骨缺损（csd）模型中，植入8 周后，p-cpgaus组实现了缺损区具有强力的骨生成能力。其骨体积分数（bv/tv）与骨密度（bmd）等核心骨形态计量学指标极显著地优于空白对照及商业 bio-gide 胶原膜。

20、优选地，所述的压电纳米复合薄膜层为聚（l-乳酸）/钛酸钡梯度复合薄膜层，具体由如下步骤制备得到：

21、s11、将聚（l-乳酸）溶解于六氟异丙醇中，配制成聚（l-乳酸）基体溶液，再向该溶液中均匀分散钛酸钡纳米颗粒，获得分散均匀的聚（l-乳酸）/钛酸钡混合前驱体纺丝液；

22、s12、将上述配制好的聚（l-乳酸）/钛酸钡纺丝液装载至注射器中，连接不锈钢注射针头，将针头接入高压直流电源，设置纺丝接收距离为8~12 cm，施加8~12 kv的纺丝电压，总纺丝时长为3.5~4.5小时；

23、s13、热退火与极化处理：将收集器上剥离的聚（l-乳酸）/钛酸钡梯度静电纺丝膜进行两步法退火处理，获得具有高压电活性的聚（l-乳酸）/钛酸钡梯度复合薄膜层。

24、进一步优选，步骤s11中，聚（l-乳酸）基体溶液的浓度为5%~20% g/ml，聚（l-乳酸）与钛酸钡的质量比为4~12:1；和/或，步骤s12中，静电纺丝的参数依次为：第0~1小时， 推进速率为 20~60 ml/min，收集器转速为 100~500 rpm；第1~2小时，推进速率为 10~30 ml/min，收集器转速为 500~1500 rpm；第2~3小时，推进速率为 8~20 ml/min，收集器转速设为1500~2800 rpm；第3.0~3.5或3.0~4.5小时，推进速率为 4~8 ml/min，收集器转速设为2800~4000 rpm；和/或，步骤s13中，两步法退火处理的具体条件是：90℃~110℃条件下退火8~12小时，随后升温至130℃~150℃继续退火8~12小时。

25、再进一步优选，步骤s11中，聚（l-乳酸）基体溶液的浓度为15% g/ml（w/v），聚（l-乳酸）与钛酸钡的质量比为10:1；和/或，步骤s12中，静电纺丝的参数依次为：第0~1小时，推进速率为 60 ml/min，收集器转速为 500 rpm；第1~2小时，推进速率为 30 ml/min，收集器转速为 1000 rpm；第2~3小时，推进速率为 15 ml/min，收集器转速设为 2000 rpm；第3~4小时，推进速率为 7.5 ml/min，收集器转速设为3000 rpm；和/或，步骤s13中，两步法退火处理的具体条件是：100℃条件下退火10小时，随后升温至140℃继续退火10小时。

26、进一步优选，设置纺丝接收距离为10 cm，施加10 kv的纺丝电压，总纺丝时长为4小时。

27、优选地，步骤s2的具体步骤为：

28、s21、将聚（l-赖氨酸）和没食子酸完全溶解于mes缓冲液中得到含聚（l-赖氨酸）和没食子酸的混合溶液，另取n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，溶解于相同的mes缓冲液中得到edc/nhs活化溶液，随后，将edc/nhs活化溶液缓慢滴加至含聚（l-赖氨酸）和没食子酸的混合溶液中，在室温及氮气保护氛围下，持续搅拌反应，反应结束后，离心处理，将收集的上清液透析，冷冻干燥后，得到没食子酸修饰的聚（l-赖氨酸）；聚（l-赖氨酸）和没食子酸的质量比为0.8~1.2:1，n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:3，聚（l-赖氨酸）与n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1~2:1；

29、s22、将步骤s1得到的没食子酸修饰的聚（l-赖氨酸）加入磷酸盐缓冲液中，配制没食子酸修饰的聚（l-赖氨酸）溶液，冰浴条件下，将甲基丙烯酸酐逐滴缓慢加入所述的没食子酸修饰的聚（l-赖氨酸）溶液中，避光条件下持续反应5~7小时，在滴加及反应过程中，保持反应体系的ph值维持在7.0~8.0之间，反应结束后，离心处理，将上清液透析，冷冻干燥后，得到含没食子酸和光交联基团的 pgm 聚合物；没食子酸修饰的聚（l-赖氨酸）溶液的浓度为4%~6% g/ml，甲基丙烯酸酐与没食子酸修饰的聚（l-赖氨酸）溶液的体积比为1:4~6。

30、进一步优选，步骤s21中，聚（l-赖氨酸）和没食子酸的质量比为1:1，聚（l-赖氨酸）与n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1.5:1；步骤s22中，没食子酸修饰的聚（l-赖氨酸）溶液的浓度为5% g/ml，甲基丙烯酸酐与没食子酸修饰的聚（l-赖氨酸）溶液的体积比为1:5。

31、优选地，步骤s3的具体步骤为：4℃冰浴避光条件下，将i型胶原蛋白溶液、pgm聚合物、10×pbs缓冲液、naoh溶液和醛基化apt19s适配体、lap光引发剂以及超纯水，充分混合均匀后，形成中性的水凝胶前驱液。

32、进一步优选，i型胶原蛋白与pgm聚合物的质量比为0.5~5:1，每毫克pgm聚合物添加0.5~10 nmol 醛基化apt19s适配体。

33、再进一步优选，i型胶原蛋白与pgm聚合物的质量比为1.66:1，每毫克pgm聚合物添加2 nmol 醛基化apt19s适配体。

34、优选地，步骤s4中，光照交联固化的具体条件为：波长为 405 nm、光强为 30 mw/cm² 的蓝光光源下垂直照射90秒。

35、本发明还保护所述的超声响应型压电janus骨再生复合膜在制备骨缺损修复、引导骨再生或牙周组织工程的植入式医疗器械中的应用。

36、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

37、1、本发明解决“单纯招募干细胞但在恶劣微环境中无法存活”的难题，先通过利用pgm聚合物的没食子酸基团清除活性氧（ros）并利用聚赖氨酸链段杀灭细菌，主动“净化”缺损微环境，建立干细胞的“抗氧化庇护所”；再在优化的微环境中，利用适配体精准捕获内源性干细胞，解决种子细胞来源问题；最后利用超声波无创穿透，激发压电层产生内建电场，与上述生物化学信号协同，高效诱导干细胞成骨分化；本发明通过上述时空级联机制，实现“1+1+1>3”的骨再生效果。

38、2、本发明通过上述材料与机制的协同，实现以下多重生物学效应：逆转病理微环境： 高效清除伤口部位过量的ros，保护线粒体功能，并抑制细菌生物膜的形成；重塑免疫微环境： 主动引导巨噬细胞从促炎的m1表型向抗炎、促修复的m2表型极化，huvec细胞分泌vegf促进血管化；增强成骨效能： 通过超声触发的压电电场，模拟天然骨的生物电环境，直接激活钙离子通道，显著加速骨基质的沉积与矿化。

39、3、本发明提供一种非侵入性、可远程调控且深部组织可达的治疗方案，利用临床通用的超声设备作为触发源，医生可根据骨愈合的不同阶段（如炎症期、增殖期、重塑期）灵活调整超声参数，实现对植入膜生物活性的按需激活，避免了二次手术，提高了患者的顺应性和治疗的安全性。

40、4、本发明提供的复合膜是具备优异生物相容性、适宜的机械强度与降解速率的理想骨修复支架。janus结构设计确保了材料既能作为坚韧的屏障阻挡软组织，又能作为仿生的细胞外基质（ecm）支持骨细胞生长，且其降解产物（如乳酸、氨基酸）可被机体完全代谢吸收，无毒副作用。