通过联合声效应-声遗传学增强靶神经元的超声响应性的方法及用途

本公开属于生物医学工程领域。本公开涉及通过联合声效应-声遗传学(acousto-sonogenetics)增强靶神经元的超声响应性的方法及用途。具体而言，本公开涉及利用纳米气泡(nanobubble，nb)和外源性机械敏感离子通道增强受试者的目标脑区的靶神经元的超声响应性的方法；治疗、预防或缓解受试者的脑部疾病或与受试者的行为相关的疾病或者控制受试者的行为的方法；以及相关的组合物/试剂盒及用途。

背景技术：

1、超声技术能够非侵入性地访问深脑区，并且具有高时空分辨率，因此在治疗多种脑部疾病方面展现出巨大的潜力。然而，传统的经颅(transcranial)超声技术在选择性调节特定神经元类型方面，缺乏足够的精确度。

2、声遗传学通过基因操作技术在神经元上表达机械敏感受体，以激活特定细胞。这种方法利用超声波实现对神经元的精确、特异性调节。然而，由于脑细胞类型的复杂性和不同的声敏感度(sonosensitivity)水平，在复杂的大脑区域靶向特定神经回路并实现有效神经调节存在挑战。此外，高强度超声可能引发脱靶刺激，对生物安全性生和携带机械敏感受体的病毒载量的担忧也进一步限制了声遗传学的有效应用。因此，利用声遗传学来实现精确、全面、高效的神经调节面临诸多挑战。

3、与光遗传学中的视蛋白(optogenetic opsins)相比，现有的机械敏感离子通道(如traak、trpa1、trpc6、piezo1和mscl)在分布均匀性和敏感度优化方面存在局限性。仅增加通道蛋白的表达可能不足以实现对神经回路的精确调节。

4、因此，鉴于现有技术的不足，亟需开发一种安全有效的方法，以优化神经调节的精度和效率并最大限度地减少不期望的副作用。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的问题，本公开引入了″声效应-声遗传学″技术。声效应-声遗传学是一种将纳米气泡技术与声遗传学相结合的新方法，其通过使纳米粒子或纳米气泡在指定的大脑区域中聚集并增强超声波效应来激活目标神经元，从而激活特定神经回路，实现有效的特异性神经调节以及相关疾病的治疗和预防。

2、本公开的第一方面提供了一种用于增强受试者的目标脑区的靶神经元的超声响应性的方法，包括：使受试者目标脑区的靶神经元表达外源性机械敏感离子通道；以及在目标脑区中存在纳米气泡的情况下向所述目标脑区施加超声波。

3、本公开的第二方面提供了一种通过增强受试者的目标脑区的靶神经元的超声响应性来治疗、预防或缓解所述受试者的脑部疾病或与所述受试者的行为相关的疾病或者控制所述受试者的行为的方法，包括：使受试者目标脑区的靶神经元表达外源性机械敏感离子通道；以及在目标脑区中存在纳米气泡的情况下向所述目标脑区施加超声波。

4、在各个方面的一些实施方案中，所述外源性机械敏感离子通道包括mscl、traak、trpa(例如trpa1和hstrpa1)、trpc(例如trpc6)、piezo(例如piezo1和piezo2)、或其任何组合。在一些实施方案中，所述外源性机械敏感离子通道包括或是mscl。在一些实施方案中，所述mscl是mscl-g22s。

5、在各个方面的一些实施方案中，所述外源性机械敏感离子通道(例如通过与所述靶神经元特异性的启动子连接)特异性靶向表达在所述靶神经元中。

6、在各个方面的一些实施方案中，所述方法包括通过编码所述外源性机械敏感离子通道的核酸载体将所述外源性机械敏感离子通道递送到所述靶神经元中。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者递送所述核酸载体，从而使所述外源性机械敏感离子通道表达在所述靶神经元中。在一些实施方案中，核酸载体包含编码所述外源性机械敏感离子通道的多核苷酸，或者核酸载体是包含编码所述外源性机械敏感离子通道的多核苷酸的核酸载体。在一些实施方案中，核酸载体还包含所述靶神经元特异性的启动子以特异性靶向所述神经元，从而在所述靶神经元中特异性表达所述外源性机械敏感离子通道。在一些实施方案中，核酸载体包含编码所述外源性机械敏感离子通道的多核苷酸以及所述靶神经元特异性的启动子。

7、在各个方面的一些实施方案中，所述核酸载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体包含编码所述外源性机械敏感离子通道的多核苷酸。在一些实施方案中，病毒载体包含编码所述外源性机械敏感离子通道的多核苷酸以及所述靶神经元特异性的启动子。在一些实施方案中，所述病毒载体包括但不限于腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、或其任何组合。在一些实施方案中，所述病毒载体包括重组病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(aav)载体，包括重组腺相关病毒(raav)载体。

8、在各个方面的一些实施方案中，所述方法包括向受试者的目标脑区(例如通过注射)递送纳米气泡。

9、在各个方面的一些实施方案中，所述方法包括向受试者分别递送纳米气泡和编码外源性机械敏感离子通道的核酸载体。例如，所述方法包括先递送纳米气泡，然后再递送核酸载体；或者所述方法包括先递送核酸载体，然后再递送纳米气泡。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者同时递送纳米气泡和核酸载体。

10、在各个方面的一些实施方案中，所述核酸载体和纳米气泡以溶液的形式存在。在一些实施方案中，所述核酸载体和纳米气泡分别存在于不同的溶液(例如第一溶液和第二溶液)或相同的溶液(例如单一溶液)中。在一些实施方案中，所述溶液还包含药学上可接受的载体或赋形剂。

11、在各个方面的一些实施方案中，所述溶液(例如第一、第二溶液或单一溶液)通过注射，例如局部注射，例如脑内局部注射来施用。在一些实施方案中，通过立体定向注射来施用所述溶液(例如第一、第二溶液或单一溶液)。

12、在各个方面的一些实施方案中，所述溶液(或者所述第一溶液)含有5×1011-5×1013vg/ml(例如6×1011-4×1012vg/ml、8×1011-3×1012vg/ml、9×1011-2×1012vg/ml、1×1012vg/ml或其间的任何数值或范围)的病毒载体。在一些实施方案中，所述溶液(或者所述第二溶液)含有4-6nm/l(例如4.5-6nm/l、5-5.5nm/l、5-6nm/l、或其间的任何数值或范围)的纳米气泡。

13、在各个方面的一些实施方案中，所述方法包括向所述向受试者的目标脑区递送大约2×1010-2.5×1010vg/kg或大约2.2×1010-2.4×1010vg/kg的核酸载体或病毒载体，和/或，大约1.6×10-4-2.0×10-4nm/kg或大约1.8×10-4nm/kg的纳米气泡或纳米气囊。

14、在各个方面的一些实施方案中，所述纳米气泡的粒径为大约30-600nm。

15、在各个方面的一些实施方案中，所述纳米气泡被修饰以增加生物相容性。在一些实施方案中，所述纳米气泡表面上接枝peg。在一些实施方案中，所述纳米气泡是纳米气囊。在一些实施方案中，所述纳米气囊的表面经peg修饰，例如其表面上接枝peg。在一些实施方案中，纳米气囊的宽度(直径)为大约60-90nm或大约65-85nm；长度为大约300-600nm或大约350-550nm；和/或长径比为大约4.5-10或5-8。

16、在各个方面的一些实施方案中，所述纳米气泡不含连接到所述机械敏感离子通道的分子或部分。在一些实施方案中，所述纳米气泡不含抗体。在一些实施方案中，靶神经元中的所述机械敏感离子通道和所述纳米气泡不连接。在一些实施方案中，所述机械敏感离子通道或编码所述机械敏感离子通道的多核苷酸或核酸载体不含能够连接到所述纳米气泡的分子或部分。

17、在各个方面的一些实施方案中，所述方法包括以0.5-5mhz的频率施加所述超声波。在一些实施方案中，所述方法包括以0.1-0.6mpa的声压施加所述超声波。

18、在各个方面的一些实施方案中，所述超声波通过超声波发生器施加。在一些实施方案中，所述超声波发生器包括台式超声波发生器、便携式超声波发生器、可佩戴超声波发生器、可植入超声波发生器或其任何组合。

19、在各个方面的一些实施方案中，所述目标脑区包括但不限于包含靶神经元的所有脑区(例如下丘脑区，包括外侧下丘脑区)。

20、在各个方面的一些实施方案中，所述靶神经元包括但不限于谷氨酸能神经元(glutamatergic neurons)、gaba能神经元(gabaergic neurons)、多巴胺能神经元(dopaminergic neurons)、胆碱能神经元(cholinergic neurons)、5-羟色胺能神经元(serotonergic neurons)、肾上腺素能神经元(adrenergic neurons)或其任何组合。

21、在各个方面的一些实施方案中，所述靶神经元包括但不限于兴奋性神经元(excitatory neurons)、抑制性神经元(inhibitory neurons)、中间神经元(intemeurons)或其任何组合。

22、在各个方面的一些实施方案中，所述靶神经元包括一种神经元或者包括两种或更多种(例如两种、三种、四种、五种或更多种)神经元的组合。

23、在各个方面的一些实施方案中，所述方法在体内进行或者所述方法是一种体内方法。在一些实施方案中，所述方法用于在受试者体内增强目标脑区的靶神经元的超声响应性。

24、在各个方面的一些实施方案中，所述受试者是动物例如哺乳动物，例如啮齿动物诸如小鼠、大鼠，或灵长类动物例如兔子、牛科动物、马科动物、羊科动物、犬科动物、猫科动物、人、猴子、黑猩猩或大猩猩。

25、在各个方面的一些实施方案中，所述脑部疾病包括但不限于阿尔茨海默病(alzheimer's disease)、帕金森病(parkinson's disease)、多发性硬化症(multiplesclerosis)、癫痫(epilepsy)、脑卒中(stroke)、创伤性脑损伤(traumatic braininjury)、睡眠障碍、抑郁症、精神分裂症、疼痛、偏头痛(migraine)、强迫性暴食症、厌食症或其任何组合。在一些实施方案中，与所述受试者的行为相关的疾病包括但不限于肥胖症、糖尿病、心血管疾病或其任何组合。在一些实施方案中，所述受试者的行为包括但不限于觅食、逃避、奖赏、惩罚、繁殖、社交、攻击、记忆、学习或其任何组合。

26、本公开的第三方面提供了编码外源性机械敏感离子通道的核酸载体与纳米气泡的组合在制备组合物中的用途，其中所述组合物在本公开第一方面和/或第二方面的任一实施方案的方法中使用。

27、本公开的第四方面提供了包含超声波发生器、编码外源性机械敏感离子通道的核酸载体与纳米气泡的组合在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒在本公开第一方面和/或第二方面的任一实施方案的方法中使用。

28、本公开的第五方面提供了编码外源性机械敏感离子通道的核酸载体与纳米气泡的组合在制备用于增强受试者的目标脑区的靶神经元的超声响应性的组合物中的用途，其中所述核酸载体靶向所述目标脑区的靶神经元并在其中表达所述外源性机械敏感离子通道。

29、本公开的第六方面提供了编码外源性机械敏感离子通道的核酸载体与纳米气泡的组合在制备用于治疗、预防或缓解受试者的脑部疾病或与所述受试者的行为相关的疾病或者控制所述受试者的行为的组合物中的用途，其中所述核酸载体靶向所述目标脑区的靶神经元并在其中表达所述外源性机械敏感离子通道。

30、本公开的第七方面提供了包含超声波发生器、编码外源性机械敏感离子通道的核酸载体与纳米气泡的组合在制备用于增强受试者的目标脑区的靶神经元的超声响应性的试剂盒中的用途，其中所述核酸载体靶向所述目标脑区的靶神经元并在其中表达所述外源性机械敏感离子通道。

31、本公开的第八方面提供了包含超声波发生器、编码外源性机械敏感离子通道的核酸载体与纳米气泡的组合在制备用于治疗、预防或缓解受试者的脑部疾病或与所述受试者的行为相关的疾病或者控制所述受试者的行为的试剂盒中的用途，其中所述核酸载体靶向所述目标脑区的靶神经元并在其中表达所述外源性机械敏感离子通道。

32、在各个方面的一些实施方案中，所述组合物或试剂盒被配制成适于在所述受试者的目标脑区接受超声波处理之前向所述目标脑区递送所述核酸载体与纳米气泡。

33、在各个方面的一些实施方案中，所述组合物或试剂盒包含约5×1011-5×1012vg/ml或约9×1011-2×1012vg/ml、1×1012vg/ml的核酸载体，和/或约4-6nm/l或约4-5.5nm/l的纳米气泡。在一些实施方案中，所述核酸载体和纳米气泡分别存在于相同或不同的溶液中。

34、在各个方面的一些实施方案中，所述组合物或试剂盒用于通过增强受试者的目标脑区的靶神经元的超声响应性来治疗、预防或缓解受试者的脑部疾病或与所述受试者的行为相关的疾病或者控制所述受试者的行为。

35、在各个方面的一些实施方案中，在超声波处理之前，所述组合物或试剂盒被施用给所述受试者以将所述核酸载体与纳米气泡递送至所述目标脑区。

36、在一些实施方案中，所述组合物或试剂盒被配制成适于分开递送所述核酸载体和纳米气泡(例如先递送核酸载体，然后再递送纳米气泡；或者先递送纳米气泡，再递送核酸载体)。在一些实施方案中，所述组合物或试剂盒被配制成适于同时递送所述核酸载体和纳米气泡。

37、在各个方面的一些实施方案中，所述核酸载体包含编码所述外源性机械敏感离子通道的多核苷酸，或者核酸载体是包含编码所述外源性机械敏感离子通道的多核苷酸的核酸载体。在一些实施方案中，核酸载体还包含所述靶神经元特异性的启动子以特异性靶向所述神经元，从而在所述靶神经元中特异性表达所述外源性机械敏感离子通道。在一些实施方案中，核酸载体包含编码所述外源性机械敏感离子通道的多核苷酸以及所述靶神经元特异性的启动子。

38、在各个方面的一些实施方案中，所述核酸载体是病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体包括但不限于腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体或其任何组合。在一些实施方案中，所述病毒载体包括重组病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(aav)载体，例如重组腺相关病毒(raav)载体。

39、在各个方面的一些实施方案中，所述外源性机械敏感离子通道包括mscl、traak、trpa(例如trpa1和hstrpa1)、trpc(例如trpc6)、piezo(例如piezo1和piezo2)、或其任何组合。在一些实施方案中，所述外源性机械敏感离子通道包括或是mscl。在一些实施方案中，所述mscl是mscl-g22s。

40、在各个方面的一些实施方案中，所述试剂盒包含本公开各个方面所定义的组合物，例如包含核酸载体和纳米气泡的组合物。

41、在各个方面的一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。

42、在各个方面的一些实施方案中，所述组合物是溶液，例如注射剂。在一些实施方案中，所述组合物包含：含有核酸载体的第一溶液(例如第一注射剂)和含有纳米气泡的第二溶液(例如第二注射剂)。在一些实施方案中，第一溶液和第二溶液作为单独的注射剂存在。在一些实施方案中，所述组合物是含有纳米气泡和核酸载体的单一溶液(例如单一注射剂)。在一些实施方案中，所述溶液或注射剂(例如第一/第二注射剂或单一注射剂)还含有药学上可接受的载体或赋形剂。

43、在各个方面的一些实施方案中，所述组合物通过注射，例如局部注射，例如脑内局部注射来施用。在一些实施方案中，通过立体定向注射来施用所述组合物。

44、在各个方面的一些实施方案中，所述组合物(或者所述第一溶液)含有5×1011-5×1012vg/ml(例如6×1011-4×1012vg/ml、8×1011-3×1012vg/ml、9×1011-2×1012vg/ml、1×1012vg/ml或其间的任何数值或范围)的病毒载体。在一些实施方案中，所述组合物(或者所述第二溶液)含有4-6nm/l(例如4.5-6nm/l、5-6nm/l、4.5-5.5nm/l、或其间的任何数值或范围)的纳米气泡。

45、在各个方面的一些实施方案中，所述组合物或试剂盒被配置成适于向受试者的目标脑区递送大约2×1010-2.5×1010vg/kg或大约2.2×1010-2.4×1010vg/kg的核酸载体或病毒载体，和/或，大约1.6×10-4-2.0×10-4nm/kg或大约1.8×10-4nm/kg的纳米气泡或纳米气囊。

46、在各个方面的一些实施方案中，所述受试者的目标脑区接受0.5-5mhz频率的超声波。在一些实施方案中，所述受试者的目标脑区接受0.1-0.6mpa声压的超声波。

47、在各个方面的一些实施方案中，所述纳米气泡的粒径为大约30-600nm。

48、在各个方面的一些实施方案中，所述纳米气泡不含连接到核酸载体或外源性机械敏感离子通道的分子或部分。在一些实施方案中，所述纳米气泡不含抗体。在一些实施方案中，靶神经元中的所述外源性机械敏感离子通道和所述纳米气泡不连接。在一些实施方案中，所述核酸载体或编码外源性机械敏感离子通道的多核苷酸不含能够连接到所述纳米气泡的分子或部分。

49、在各个方面的一些实施方案中，所述纳米气泡被修饰以增加生物相容性。在一些实施方案中，所述纳米气泡表面上接枝peg。在一些实施方案中，所述纳米气泡是纳米气囊。在一些实施方案中，所述纳米气囊的表面经peg修饰，例如其表面上接枝peg。在一些实施方案中，纳米气囊的宽度为大约60-90nm或大约65-85nm；长度为大约300-600nm或大约350-550nm；和/或长径比为大约4.5-10或5-8。

50、在各个方面的一些实施方案中，所述超声波通过超声波发生器施加。在一些实施方案中，所述超声波发生器包括台式超声波发生器、便携式超声波发生器、可佩戴超声波发生器、可植入超声波发生器或其任何组合。

51、在各个方面的一些实施方案中，所述目标脑区包括但不限于包含靶神经元的所有脑区(例如下丘脑区，包括外侧下丘脑)。

52、在各个方面的一些实施方案中，所述靶神经元包括但不限于谷氨酸能神经元、gaba能神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、5-羟色胺能神经元、肾上腺素能神经元或其任何组合。

53、在各个方面的一些实施方案中，所述靶神经元包括但不限于兴奋性神经元、抑制性神经元、中间神经元或其任何组合。

54、在各个方面的一些实施方案中，所述靶神经元包括一种神经元或者包括两种或更多种(例如两种、三种、四种、五种或更多种)神经元的组合。

55、在各个方面的一些实施方案中，所述受试者是动物例如哺乳动物，例如啮齿动物诸如小鼠、大鼠，或灵长类动物例如兔子、牛科动物、马科动物、羊科动物、犬科动物、猫科动物、人、猴子、黑猩猩或大猩猩。

56、在各个方面的一些实施方案中，所述脑部疾病包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、癫痫、脑卒中、创伤性脑损伤、睡眠障碍、抑郁症、精神分裂症、疼痛、偏头痛、强迫性暴食症、厌食症或其任何组合。在一些实施方案中，与所述受试者的行为相关的疾病包括但不限于肥胖症、糖尿病、心血管疾病或其任何组合。在一些实施方案中，所述受试者的行为包括但不限于觅食、逃避、奖赏、惩罚、繁殖、社交、攻击、记忆、学习或其任何组合。

57、本公开的方法或用途结合了声遗传学手段以及能够定位超声波并将其能量放大到邻近细胞的纳米气泡。通过纳米气泡(例如纳米气囊)来增强超声波效果，利用声遗传学的优点，本公开的方法或用途能够降低超声激活阈值，从而以较低的声能实现对复杂大脑区域内特定神经回路的精确、靶向性的神经调节，而不会不利地影响非目标脑区。本公开的方法或用途能够特异性激活目标神经元，调节特定神经回路，从而有效控制动物的行为(例如觅食行为)，因此在脑部疾病或与动物行为相关的疾病的治疗和预防方面具有重要的应用价值。