ENO1在诊断及治疗腹膜后平滑肌肉瘤中的应用

本发明涉及生物医药，具体地，本发明涉及eno1在诊断及治疗腹膜后平滑肌肉瘤中的应用。

背景技术：

1、腹膜后平滑肌肉瘤（retroperitoneal leiomyosarcoma，rplms）是一种罕见但具有高度侵袭性的软组织肉瘤，起源于腹膜后的平滑肌细胞。由于其解剖位置隐蔽，且早期缺乏特异性的临床症状，rplms常常在肿瘤显著增大后才被发现。患者就诊时，通常肿瘤原发病灶已经很大，且局部复发倾向很强。尽管手术切除仍是治疗的基石，但要实现肿瘤的完整切除，手术技术要求非常高。同时，目前可用的化疗和放疗手段效果也比较有限。因此，这类患者的长期治疗效果仍不理想，这也凸显出我们有必要进一步深入了解这种疾病的分子机制。

2、烯醇化酶1（eno1）是糖酵解过程中的一个核心酶，主要负责催化2-磷酸甘油酸向磷酸烯醇式丙酮酸的转化。然而，eno1在腹膜后平滑肌肉瘤中的异常表达及其对rplms疾病进展的功能性研究尚未明确。

技术实现思路

1、为了弥补现有技术的不足，本发明的目的是提供eno1在诊断及治疗腹膜后平滑肌肉瘤中的应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面提供eno1抑制剂在制备治疗腹膜后平滑肌肉瘤的药物中的应用。

4、在本发明中，eno1包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的eno1，源自细胞中加工的任何形式的eno1，以及eno1的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如人的eno1以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的eno1，人类eno1基因id：2023。

5、在本发明中，治疗可指治疗性处理或预防性措施，其中目标是预防或减慢(减轻)非期望的生理状况、障碍或疾病，或获得有益的或所需的临床结果。在本发明中，治疗既可以指代治疗也可以指代预防。有益的或所需的临床结果包括但不限于缓解症状；减轻病症、障碍或疾病的程度；稳定(即，不恶化)病症、障碍或疾病的状态；延迟病症、障碍或疾病的发生或减缓其进展；改善病症、障碍或疾病状态；以及缓解(无论是部分的还是完全的)(无论是可检测的还是不可检测的)或改进或改善病症、障碍或疾病。治疗可包括引起临床上明显的反应，而无过度的副作用。治疗还包括相比未接受治疗时的预期存活期延长的存活期。

6、进一步，所述抑制剂包括核酸抑制剂、蛋白抑制剂。

7、进一步，所述核酸抑制剂包括sirna、shrna、核酶、反义寡核苷酸。

8、进一步，所述核酸抑制剂选自sirna或shrna。

9、进一步，所述sirna或shrna以可表达的形式插入病毒载体中。

10、进一步，所述病毒载体包括慢病毒载体或腺相关病毒载体。

11、进一步，所述sirna或shrna的序列如seq id no:1或seq id no:2所示。

12、在本发明中，抑制剂是指能与eno1，优选人eno1特异性结合，或与eno1的多核苷酸或其片段结合，并抑制eno1蛋白或多核苷酸的活性和/或表达。其包括核酸抑制剂、蛋白抑制剂。

13、其中，蛋白抑制剂包括抗体，所述抗体是单克隆的、嵌合的、人的或人源化的抗体，或是抗体片段或合成抗体。

14、所述核酸抑制剂是未经修饰的，或用一种或多种选自由以下组成的组的化学基团修饰：2'o-甲氧基、硫代磷酸酯、锁核酸和胆固醇。

15、在本发明的实施方案中，所述抑制剂选自核酸抑制剂，所述核酸抑制剂包括sirna、shrna、核酶、反义寡核苷酸。

16、其中，sirna(小干扰rna)是指分离的rna分子，优选长度大于10个核苷酸，更优选长度大于15个核苷酸，最优选长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，所述rna分子用于识别待降解的靶基因或mrna。19～25个核苷酸的范围是sirna最优选的大小。

17、sirna可包括部分纯化的rna、基本上纯的rna、合成的rna或重组产生的rna以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然rna的改变的rna。所述改变可包括添加非核苷酸物质，例如添加到sirna的末端或sirna的一个或多个内部核苷酸；使sirna抵抗核酸酶消化的修饰(例如，使用2'-取代的核糖核苷酸或者对糖磷酸骨架进行修饰)；或用脱氧核糖核苷酸替换sirna中的一个或多个核苷酸。另外，如上文中针对经修饰的寡核苷酸所述的，可修饰sirna以提高其稳定性，尤其是通过引入一个或多个硫代磷酸酯连接来实现。

18、shrna(小发夹rna)是能够形成发夹结构的非编码小rna分子，shrna能够通过rna干扰途径来抑制基因的表达。

19、反义寡核苷酸(反义核酸序列)可包括与编码蛋白质的有义核酸互补(例如与双链cdna分子编码链互补或与eno1 mrna互补)的核苷酸序列。反义寡核苷酸和递送方法是本领域众所周知的(goodchild，curr.opin.mol.ther.，6(2)：120-128(2004)；clawson等，genether.，11(17)：1331-1341(2004))，其通过引用以其整体结合到本发明中。反义寡核苷酸可与靶序列的完整编码链互补，或仅与其部分互补。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸对eno1 mrna中的核苷酸序列的编码链的非编码区而言是反义的。反义寡核苷酸的长度可以是例如约7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80个或更多个核苷酸。

20、核酶是可经工程改造而以特异性序列依赖性方式酶促切割和钝化其它rna靶标的一类rna。核酶及其递送方法是本领域众所周知的(hendry等，bmcchem.biol.，4(1)：1(2004)；g rassi等，curr.pharm.biotechnol .，5 (4)：369-386(2004)；bagheri等，curr.mol.med.，4(5)：489-506(2004)；kashani-sabetm.， expertopin.biol.ther.，4(11)：1749-1755(2004)，其各自通过引用以其整体结合到本发明中。通过切割靶rna，核酶抑制翻译，因而阻止靶基因的表达。可采用本领域已知方法，在实验室中化学合成核酶并对其进行结构修饰以增加其稳定性和催化活性。或者，可通过本领域已知的基因递送机制，将核酶基因引入细胞中。

21、在本发明的具体实施方案中，核酸抑制剂选自sirna。

22、进一步，所述治疗腹膜后平滑肌肉瘤包括抑制腹膜后平滑肌肉瘤细胞的增殖和/或迁移能力。

23、进一步，所述药物的剂型选自注射药剂、喷剂、胶囊、片剂、丸剂、颗粒冲剂、散剂、口服液中的任意一种。

24、进一步，所述药物的施用方式包括口服、皮下、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、粘膜或腹腔注射。

25、在一些实施方案中，所述药物的剂型包括但不限于：片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、锭剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、控制释放制剂、气雾剂、膜剂、注射剂、静脉滴注剂、透皮吸收制剂、软膏剂、洗剂、粘附制剂、鼻制剂、肺制剂等，以便患者摄入。

26、在一些实施方案中，合适的药物的给药方式包括本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种，以将本发明所述的药物物理引入到受试者体内，所述给药方式包括但不限于：口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、鼻给药、颊给药或通过植入的贮药装置给药。在药物用于注射给药的情况下，其可采用在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式并且其可含有配制试剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。

27、本发明第二方面公开一种药物组合物。

28、进一步，所述药物组合物包括eno1抑制剂。

29、进一步，所述eno1抑制剂为sirna。

30、进一步，所述sirna的序列如seq id no:1或seq id no:2所示。

31、进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

32、进一步，所述药学上可接受的载体包括稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

33、在一些实施方案中，所述稀释剂包括但不限于：乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等。

34、在一些实施方案中，所述粘合剂包括但不限于：淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等。

35、在一些实施方案中，所述表面活性剂包括但不限于：聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等。

36、在一些实施方案中，所述致湿剂包括但不限于：甘油、淀粉等。

37、在一些实施方案中，所述吸附载体包括但不限于：淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等。

38、在一些实施方案中，所述润滑剂包括但不限于：硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等。

39、在一些实施方案中，所述填充剂包括但不限于：甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等。

40、在一些实施方案中，所述崩解剂包括但不限于：交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

41、在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体可另外含有液体，诸如水、生理盐水、甘油和乙醇。

42、进一步，所述药物组合物还包括第二治疗剂。

43、进一步，所述第二治疗剂为其他治疗腹膜后平滑肌肉瘤的药物。

44、进一步，所述其他治疗腹膜后平滑肌肉瘤的药物包括多柔比星、异环磷酰胺、吉西他滨、多西他赛、达卡巴嗪、曲贝替定、安罗替尼中的一种或多种。

45、在一些实施方案中，本发明所述的eno1抑制剂还可与其他治疗腹膜后平滑肌肉瘤的药物联合使用，联合使用包括同时使用或依次使用，使得治疗有效量的本发明所述的eno1抑制剂和一种或多种其他治疗腹膜后平滑肌肉瘤的药物均存在于患者体内。

46、在一些实施方案中，联合使用包括在施用单位剂量的一种或多种其他治疗腹膜后平滑肌肉瘤的药物之前或之后或同时施用单位剂量的本发明所述的eno1抑制剂，例如，可以在施用一种或多种其他治疗腹膜后平滑肌肉瘤的药物的数秒、数分钟或数小时内，施用本发明所述的eno1抑制剂；例如，也可以首先施用单位剂量的本发明所述的eno1抑制剂的数秒、数分钟或数小时内，施用单位剂量的一种或多种其他治疗腹膜后平滑肌肉瘤的药物；例如，也可以同时施用单位剂量的一种或多种其他治疗腹膜后平滑肌肉瘤的药物和本发明所述的eno1抑制剂。

47、本发明第三方面提供eno1抑制剂在制备体外抑制腹膜后平滑肌肉瘤细胞的增殖和/或迁移的试剂中的应用。

48、进一步，所述抑制剂包括核酸抑制剂、蛋白抑制剂。

49、进一步，所述核酸抑制剂包括sirna、shrna、核酶、反义寡核苷酸。

50、进一步，所述核酸抑制剂选自sirna。

51、进一步，所述sirna的序列如seq id no:1或seq id no:2所示。

52、本发明第四方面提供检测样本中eno1表达水平的试剂在制备诊断腹膜后平滑肌肉瘤的产品中的应用。

53、进一步，所述试剂包括特异性识别eno1的寡核苷酸探针、特异性扩增eno1的引物或特异性结合eno1编码的蛋白的结合剂。

54、进一步，所述试剂选自特异性扩增eno1的引物。

55、进一步，所述特异性扩增eno1的引物序列如seq id no:3或seq id no:4所示。

56、进一步，所述样本包括组织、血液。

57、进一步，所述试剂还包括可检测标记。

58、在本发明中，探针可以是例如全长靶基因核酸或其部分，例如长度为至少15、30、50、100、250或500个核苷酸并且足以在严格条件下与靶基因mrna或基因组dna特异性杂交的寡核苷酸。

59、在本发明中，引物是指短的核酸分子，例如dna寡核苷酸，例如至少15个核苷酸的序列，可以通过核酸杂交与互补的靶核酸分子退火，在引物和靶核酸链之间形成杂交体。引物可以通过聚合酶沿着靶核酸分子延伸。因此，引物可用于扩增靶核酸分子，其中引物的序列对于靶核酸分子是特异性的，例如引物将在非常高严紧性杂交条件下与靶核酸分子杂交。

60、在本发明中，特异性结合是指其中两种或更多种分子形成可在生理或测定条件下测量的复合物并为选择性的情况。将抗体或抗原结合蛋白或其他分子在以下情况下称为特异性结合到蛋白、抗原或表位：在适当选择的条件下，这种结合不受到实质性抑制，而同时非特异性结合受到抑制。特异性结合的特征在于高亲和力以及对化合物、蛋白、表位或抗原的选择性。非特异性结合通常具有较低的亲和力。

61、在本发明中，标记是指能够产生表明在测定样品中存在靶多核苷酸的可检测信号的组合物。合适的标记包括但不限于放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、荧光分子、化学发光部分、磁粒、生物发光部分。因此，标记是能够由装置或方法检测的任意组合物，包括但不限于光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学、化学检测装置或任何其他合适的装置。在一些实施方案中，标记可无需借助于装置而在视觉上检测。标记用于指代具有可检测的物理性质的任何化学基团或部分或能够导致化学基团或部分表现出可检测的物理性质的任何化合物，诸如催化底物转化成可检测产物的酶。标记还涵盖抑制特定物理性质的表现的化合物。标记也可以是作为结合对的成员的化合物，其另一个成员具有可检测的物理性质。

62、其中，放射性同位素包括但不限于3h、14c、35s、125i、131i。

63、酶包括但不限于辣根过氧化物酶、β半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酶。

64、荧光分子包括但不限于fitc、罗丹明、镧系磷光体(lanthanide phosphors)。

65、本发明第五方面提供一种诊断腹膜后平滑肌肉瘤的产品。

66、进一步，所述产品包括检测样本中eno1表达水平的试剂。

67、进一步，所述试剂选自特异性扩增eno1的引物。

68、进一步，所述特异性扩增eno1的引物序列如seq id no:3或seq id no:4所示。

69、进一步，所述产品包括试剂盒、试纸、芯片。

70、在本发明中，试剂盒还包括缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒也可包含用于检测可检测试剂的必要成分(例如底物)。试剂盒也可含有对照样品或一系列对照样品，其可被测定并与所含有的试验样品进行比较。试剂盒的每种成分通常都封装在单独容器中，所有不同容器都装入一个包装中并带有用于观察试验受试者是否患有靶基因异常表达相关疾病或处于发展所述疾病的风险之中的说明书。

71、试剂盒的其它成分包括但不限于：用于采集生物样品的工具、用于标记检测试剂(结合剂)的工具、用于固定生物样品中的eno1蛋白或eno1核酸的膜、用于将生物样品加样到膜上的工具、用于使试剂与受试者生物样品中的eno1结合的工具、第二抗体、用于从受试者生物液体中分离总rna的工具、用于进行凝胶电泳的工具、用于从分离的总rna产生cdna的工具、用于进行杂交测定的工具，以及用于进行pcr的工具。

72、试剂盒可任选包括有关试剂盒成分和/或如何进行各种测定(例如eno1水平、与对照标准品的比较等)的信息的一组印刷形式或电子形式(例如磁盘或光盘)的说明书。试剂盒也可作为更大的包装的组成部分而市售，所述包装包括用于测定其它生物化学成分的仪器。

73、本发明第六方面提供eno1作为靶标在筛选治疗腹膜后平滑肌肉瘤的候选药物中的应用。

74、本发明第七方面提供如下任一项方法：

75、（1）一种筛选治疗腹膜后平滑肌肉瘤候选药物的方法，所述方法包括：测试待测试物质对样本中eno1表达水平的影响，其中，在使用待测试物质后，eno1水平降低，表明该待测试物质是治疗腹膜后平滑肌肉瘤的候选药物；

76、进一步，所述候选药物包括但不限于蛋白质类似物、抗体、dna、rna、小分子化合物。

77、（2）一种体外非治疗目的的抑制腹膜后平滑肌肉瘤细胞增殖和/或迁移的方法，所述方法包括向腹膜后平滑肌肉瘤细胞施用eno1抑制剂；

78、进一步，所述核酸抑制剂选自sirna。

79、进一步，所述sirna的序列如seq id no:1或seq id no:2所示。

80、本发明的优点和有益效果：

81、在本研究中，我们发现eno1在rplms患者中显著上调，且沉默eno1后能够显著抑制rplms细胞的增殖和迁移能力，我们的结果表明eno1可作为rplms患者的诊断标志物和治疗靶点。本研究首次探讨了eno1在rplms中的意义，为rplms的机制研究提供了新的见解，也为rplms的治疗提供了新的视角。