一种增强抗白色念珠菌免疫保护效果的mRNA疫苗及其应用

本发明涉及生物，具体涉及一种增强抗白色念珠菌免疫保护效果的mrna疫苗及其应用。

背景技术：

1、侵袭性真菌感染（invasive fungal infections，ifis）是全球范围内严重威胁公共健康的重要感染性疾病之一。随着肿瘤化疗、器官移植、造血干细胞移植、免疫抑制剂应用以及重症监护医学的发展，免疫功能受损患者数量持续增加，侵袭性真菌感染的发病率和死亡率仍呈上升趋势。其中，白色念珠菌（

candida albicans）是导致侵袭性念珠菌病最常见的机会致病真菌，可引起血流感染、肾脏感染及多器官播散性感染，其病死率仍然较高。

2、目前，侵袭性白色念珠菌感染的临床治疗主要依赖唑类、多烯类及棘白菌素类等抗真菌药物。然而，由于药物毒副作用、耐药菌株不断出现、治疗费用较高以及感染发生时患者免疫功能通常已严重受损，仅依赖抗真菌药物仍难以显著降低侵袭性白色念珠菌感染导致的死亡率。因此，通过疫苗接种建立宿主保护性免疫，在感染发生前获得持续的免疫保护，被认为是降低侵袭性白色念珠菌感染发生率和死亡率的重要策略。

3、近年来，针对白色念珠菌的疫苗研究取得了一定进展，包括减毒活疫苗、灭活疫苗、蛋白亚单位疫苗、多肽疫苗以及核酸疫苗等多种技术路线。其中，以als3（agglutinin-like sequence 3）蛋白为代表的黏附相关蛋白抗原因能够诱导一定程度的保护性免疫而受到广泛关注，并已发展出以als3 n端结构域（als3p-n）为主要抗原的候选疫苗。与此同时，随着脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，lnp）递送技术和线性mrna技术的快速发展，mrna疫苗具有设计灵活、生产周期短、体内表达效率高及能够同时诱导体液免疫和细胞免疫等优势，为新型抗真菌疫苗的研发提供了新的技术路线。

4、然而，与病毒疫苗和部分细菌疫苗相比，目前抗真菌疫苗仍处于研发阶段，尚无获批上市的人用白色念珠菌疫苗。虽然近年来白色念珠菌疫苗研究取得了一定进展，但现有技术仍存在以下不足：（1）现有候选疫苗保护效果有限。目前大多数白色念珠菌候选疫苗主要采用蛋白抗原或蛋白亚单位作为免疫原，其诱导的保护作用有限，不同实验体系之间保护效果差异较大，难以稳定获得较高水平的感染保护。（2）针对免疫功能受损宿主的保护能力尚不明确。侵袭性白色念珠菌感染主要发生于免疫功能受损患者，而目前大多数候选疫苗仅在免疫功能正常动物模型中进行评价，对于宿主先天免疫功能缺陷情况下是否仍具有保护作用缺乏充分研究，限制了其临床转化价值。（3）现有mrna抗真菌疫苗研究仍较少。虽然mrna疫苗技术已在病毒疫苗领域获得广泛应用，但针对白色念珠菌感染的mrna疫苗研究仍相对有限。如何利用mrna疫苗诱导更加有效、更加持久的抗真菌保护性免疫，目前仍缺乏成熟的技术方案。（4）针对基因缺陷所致免疫功能受损人群的疫苗策略存在空白。临床上，因特定基因缺陷（如card9、dectin-1等功能缺失性突变）而罹患侵袭性白色念珠菌感染的患者群体客观存在且日益受到关注。然而，现有疫苗研发体系均基于免疫功能正常的动物模型或健康受试者数据，尚未有任何技术方案针对此类基因缺陷导致的先天免疫通路障碍进行疫苗设计与效果验证。这导致该类临床高易感人群无法从现有疫苗策略中获益，构成了明确的、未被满足的临床需求。

5、因此，亟需开发一种能够有效诱导针对白色念珠菌保护性免疫的新型mrna疫苗，在免疫功能正常宿主及免疫功能受损宿主中均能够建立有效免疫保护，从而提高宿主对系统性白色念珠菌感染的抵抗能力。

技术实现思路

1、本发明旨在克服现有白色念珠菌候选疫苗保护效果有限以及在抗真菌免疫功能缺陷宿主中保护能力不足等技术缺陷，提供一种能够同时表达白色念珠菌保护性抗原和免疫调控因子的线性mrna疫苗及其制备方法和应用。

2、第一方面，本发明要求保护一种抗白色念珠菌的mrna疫苗。

3、本发明所要求保护的抗白色念珠菌的mrna疫苗中包含编码融合多肽的mrna分子；

4、所述融合多肽自n端到c端依次由tpa信号肽、来自于白色念珠菌的als3p-n抗原、furin切割位点、p2a自剪切肽和il-23融合而成。

5、进一步地，所述tpa信号肽的氨基酸序列为seq id no:1的第1-23位或者与seq idno:1的第1-23位具有80%以上同一性的氨基酸序列。所述als3p-n抗原的氨基酸序列为seqid no:1的第24-439位或者与seq id no:1的第24-439位具有80%以上同一性的氨基酸序列。所述furin切割位点的氨基酸序列为seq id no:1的第440-443位或者与seq id no:1的第440-443位具有80%以上同一性的氨基酸序列。所述p2a自剪切肽的氨基酸序列为seq idno:1的第444-466位或者与seq id no:1的第444-466位具有80%以上同一性的氨基酸序列。所述il-23为小鼠il-23或人源il-23。更进一步地，所述小鼠il-23的氨基酸序列为seq idno:1的第467-983位或者与seq id no:1的第467-983位具有80%以上同一性的氨基酸序列。所述人源il-23的氨基酸序列为seq id no:3位或者与seq id no:3具有80%以上同一性的氨基酸序列。

6、在本发明的一些实施案例中，所述融合多肽的氨基酸序列为seq id no:1或者seqid no:1的第1-983位，或者与seq id no:1或seq id no:1的第1-983位具有80%以上同一性的氨基酸序列。其中，seq id no:1的第984-988位为gggs序列（linker），第989-994位为6his标签。

7、在本发明的另一些案例中，所述融合多肽的氨基酸序列可为在seq id no:1或者seq id no:1的第1-983位基础上，将seq id no:1的第467-983位替换为seq id no:3后所得序列；或者与替换后序列具有80%以上同一性的氨基酸序列。

8、更进一步地，所述mrna分子自5'端至3'端依次包含（或由如下组成）：5'帽结构、5'非翻译区、编码元件、3'非翻译区以及poly(a)尾；其中，所述编码元件编码所述融合多肽。更加具体地，在所述编码元件中，编码所述tpa信号肽的核酸序列可为将seq id no:2的第1-69位所示核苷酸序列中的t替换为u后所得序列，编码所述als3p-n抗原的核酸序列可为将seq id no:2的第70-1317位所示核苷酸序列中的t替换为u后所得序列，编码所述furin切割位点的核酸序列可为将seq id no:2的第1318-1329位所示核苷酸序列中的t替换为u后所得序列，编码所述p2a自剪切肽的核酸序列可为将seq id no:2的第1330-1398位所示核苷酸序列中的t替换为u后所得序列，编码所述il-23的核酸序列可为将seq id no:2的第1399-2949位所示核苷酸序列中的t替换为u后所得序列。

9、在本发明的一些实施案例中，所述编码元件的核酸序列为将seq id no:2或seqid no:2的第1-2949位所示核苷酸序列中的t替换为u后所得序列；或，所述编码元件的核酸序列为将与seq id no:2或seq id no:2的第1-2949位具有80%以上同一性的核苷酸序列中的t替换为u后所得序列。其中，seq id no:2的第2950-2964位为编码gggs序列（linker）的核苷酸序列，第2965-2982位为编码6his标签的核苷酸序列。

10、在本发明的另一些案例中，所述编码元件的核酸序列为在seq id no:2或seq idno:2的第1-2949位基础上，将seq id no:2的第1399-2949位（小鼠il-23的编码基因）替换为seq id no:4（人源il-23的编码基因），并将所得核苷酸序列中的t替换为u后所得序列；或，所述编码元件的核酸序列为与在seq id no:2或seq id no:2的第1-2949位基础上将seq id no:2的第1399-2949位替换为seq id no:4所得核苷酸序列具有80%以上同一性，且将其中的t替换为u后所得序列。

11、在本发明的一些实施案例中，所述mrna分子是经体外转录获得的，进行所述体外转录时，利用t7 rna体外转录试剂盒和帽子类似物（具体为cap gag(3'ome) m7(3'omeg)(5')ppp(5')(2'omea)pg）进行共转录加帽，后利用polya聚合酶对线性rna进行加尾反应。

12、进一步地，所述mrna疫苗可包含所述mrna分子与脂质纳米颗粒，形成mrna-脂质纳米颗粒复合物。在本发明的一些实施案例中，所述mrna分子被负载于脂质纳米颗粒，形成mrna-脂质纳米颗粒复合物。具体地，所述脂质纳米颗粒中的脂质组分包括：可电离脂质、磷脂、胆固醇和peg化脂质。

13、在本发明的一些实施案例中，所述可电离脂质具体为sm-102，其占总脂质体的摩尔百分含量范围可在30%-60%。所述磷脂具体为dspc，其占总脂质体的摩尔百分含量范围可在5%-20%。所述peg化脂质具体为dmg-peg 2000，其占总脂质体的摩尔百分含量范围可在1%-5%。所述胆固醇成分占总脂质体的摩尔百分含量范围可在30%-50%。其中，所述总脂质体是指组成所述脂质纳米颗粒的sm-102、dspc、dmg-peg 2000和胆固醇这四种物质的总和（即前文所述脂质组分），所述四种物质的摩尔百分含量之和为100%。

14、在本发明的一些实施案例中，在所述复合物中，所述mrna分子和所述脂质组分的质量比为1：20-1：50（如1：30）。

15、在本发明的一些实施案例中，所述脂质纳米颗粒中，可电离脂质（具体为sm-102）、磷脂（具体为dspc）、胆固醇和peg化脂质（具体为dmg-peg 2000）的摩尔比为50:10:38.5:1.5。

16、在本发明的一些实施案例中，将可电离脂质（具体为sm-102）、磷脂（具体为dspc）、胆固醇和peg化脂质（具体为dmg-peg 2000）溶解于有机相中（具体为乙醇），按照摩尔比为50:10:38.5:1.5的比例混合，得到其中所述脂质组分浓度为18μg/μl的有机相溶液；将前文第一方面中所述的mrna分子溶解于水相中（如选用酸性的柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液，再如可为100mm，ph4的柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液），得到其中所述mrna分子浓度为200ng/μl的水相溶液；然后将所述水相溶液和所述有机相溶液按照（2-5）：1（如3:1）的体积比混合，通过自组装形成包封有mrna的lnp颗粒，即得到所述复合物。其中，可采用微流控混合技术实现将所述水相溶液和所述有机相溶液快速混合。

17、在本发明中，氨基酸序列之间的序列一致性数值，可借助公开网络序列比对平台完成测算，典型平台为ncbi官网提供的blast在线工具。示例性操作方式：采用高级blast2.1程序套件，比对程序选择blastp；期望阈值（expect）设定为 10，全部过滤选项关闭；打分矩阵选用blosum62；空位开放罚分、单位空位延伸罚分、λ系数依次设定为11、1、0.85（程序默认参数）；执行双序列比对后输出序列一致性百分比。文中所述80%以上的同一性，包括但不限于80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

18、在本发明中，核苷酸序列之间的序列一致性数值，可利用互联网公开的序列比对网站进行测定，例如ncbi官方网站搭载的blast检索页面。示例性比对条件：选用高级blast2.1工具，比对程序选定blastn；期望阈值（expect）设置为10，关闭全部过滤条件；沿用 blastn 默认计分规则，碱基匹配得分+2、错配罚分-3；空位开放罚分、单位空位延伸罚分与λ系数采用程序默认参数；完成两条核苷酸序列比对运算后得到序列一致性百分比。文中所述80%以上的同一性，包括但不限于80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

19、第二方面，本发明要求保护与前文第一方面所述mrna疫苗相关的生物材料。

20、本发明所要求保护的生物材料为前文第一方面中所述的mrna分子、或能够转录得到所述mrna分子的dna分子、或含有所述dna分子的表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞。

21、其中，所述表达盒可为一类dna片段，该片段含有能够转录生成前文所述mrna分子的dna序列以及各类必需调控元件，能够直接介导rna的转录过程；所述表达盒可以包含启动子、编码序列以及终止子，启动子用于起始dna向rna的转录反应，终止子用于终止转录进程。表达盒还可以增设其他可选调控元件，例如增强子序列，用以提升转录效率。

22、所述重组载体可为以天然载体作为骨架，借助基因克隆手段插入前文所述dna分子或上述表达盒所构建得到的重组dna分子；天然载体示例性包括质粒载体、病毒载体。质粒载体可选puc系列、pcdna系列质粒等，该类质粒搭载表达盒序列，既能够在细菌体内实现复制扩增，也可转染至真核细胞内启动转录。病毒载体可选腺病毒载体、慢病毒载体等，能够将dna分子高效递送至动物细胞等靶细胞，并依托病毒自身调控机制启动转录。

23、所述重组菌株可为将上述重组载体转入大肠杆菌dh5α、bl21等宿主细菌构建得到的基因工程菌。细菌具备增殖迅速的特点，培养该重组菌株能够快速制备大量携带目标dna分子的重组载体，为后续体外转录制备rna提供原料。

24、所述重组细胞可为将重组载体或者表达盒导入哺乳动物细胞、昆虫细胞等真核宿主细胞后构建得到的工程细胞。

25、第三方面，本发明要求保护前文第二方面所述生物材料在如下任一中的应用：

26、（a1）制备前文第一方面所述mrna疫苗；

27、（a2）制备用于预防和/或治疗白色念珠菌感染的药物。

28、进一步地，所述mrna疫苗或所述药物用于在免疫正常宿主和/或抗真菌功能缺陷宿主中预防和/或治疗白色念珠菌感染。在本发明中，所述宿主可为人或小鼠。

29、更进一步地，所述抗真菌功能缺陷宿主为携带card9和/或dectin-1等基因功能丧失突变，由该突变引发抗真菌固有免疫缺陷，进而易感侵袭性白色念珠菌感染的个体。

30、进一步地，所述药物还可以含有一种或多种药学上容许的载体、稀释剂和/或辅料。

31、所述载体主要用于承载与递送活性药物成分，通常还能够协助活性成分发挥药效或是提高制剂稳定性；例如聚乳酸-羟基乙酸共聚物等高分子载体材料，可以包载难溶性活性物质，实现活性成分在体内的缓释，延长作用时长。所述稀释剂用于降低活性成分浓度，增加制剂的重量或体积，代表性种类包括乳糖、淀粉、甘露醇等。所述辅料是各类用于成型制剂的辅助物质的统称：例如聚维酮这类黏合剂，可促使药粉相互结合，满足片剂压制成型需求；交联聚维酮等崩解剂，能够促使片剂进入机体后迅速崩散，加快活性成分溶出与吸收。

32、与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下显著的有益效果：

33、（1）本发明构建了依次包含tpa信号肽、als3p-n抗原、furin切割位点、p2a自剪切肽和mil-23的重组编码结构，即：tpa-als3p-n-furin-p2a-mil-23。

34、与分别制备、分别包封和分别给予抗原mrna与il-23 mrna的方案相比，本发明利用单一开放阅读框同时编码白色念珠菌保护性抗原和免疫调控因子，可使两种功能模块由同一mrna-lnp制剂共同递送，减少不同mrna制剂之间因包封率、体内分布、细胞摄取效率及给药剂量差异造成的不确定性。

35、通过上述串联设计，可以在启动白色念珠菌抗原特异性免疫的同时提供il-23相关免疫调控信号，从而实现抗原递送与免疫增强功能的一体化。

36、（2）本发明采用als3p-n作为白色念珠菌保护性抗原。als3p-n mrna经脂质纳米颗粒递送后，可在宿主细胞内表达相应抗原，并诱导针对白色念珠菌的适应性免疫反应。

37、（3）本发明提供的mrna疫苗在免疫功能正常宿主及免疫功能受损宿主中均能够建立有效免疫保护，从而提高宿主对系统性白色念珠菌感染的抵抗能力。

38、本发明对于防治白色念珠菌感染，尤其是存在抗真菌固有免疫缺陷宿主的白色念珠菌感染具有重要意义。