一种靶向白色念珠菌V-ATPaseV0c'亚基以抑制其毒力的药物的筛选方法及其应用与流程

本发明涉及药物筛选及应用，具体涉及一种靶向白色念珠菌v-atpasev0c'亚基以抑制其毒力的药物的筛选方法及其应用。

背景技术：

1、白色念珠菌是诱发人体口腔念珠菌感染最主要的致病性真菌病原体，该类真菌感染高发于老年人群及免疫力低下人群。当人体口腔微环境失衡、机体免疫防御能力下降时，白色念珠菌易大量异常增殖，进而引发口腔黏膜充血、白斑、糜烂、疼痛等系列病理损伤，严重破坏口腔正常生理结构与进食功能。若口腔白色念珠菌感染未能得到及时有效干预，病情持续迁延还会进一步诱发深部侵袭性真菌感染，对机体造成持续性损伤，严重威胁特殊易感人群的身体健康与生活质量，因此，高效、精准、安全地防控白色念珠菌口腔感染，是口腔临床抗感染治疗领域的重点研究方向。

2、针对白色念珠菌引发的口腔感染问题，现有技术主要依托传统抗真菌药物研发与筛选体系获取治疗药物，通过体外抑菌活性验证、菌株杀伤效果评估、药理活性筛查等常规手段，筛选具备白色念珠菌抑制、杀灭活性的广谱抗真菌药物。现有筛选技术主要围绕真菌整体抑菌、杀菌效果开展活性筛选，以药物对白色念珠菌的增殖抑制能力、菌株清除效果为核心评价指标，筛选得到的药物多通过干扰真菌细胞膜合成、阻断真菌基础代谢通路、抑制真菌菌体增殖等通用机制发挥抗感染作用，以此实现口腔念珠菌病的临床治疗与症状控制。

3、然而，现有白色念珠菌感染药物筛选技术及对应的临床治疗方案存在诸多难以突破的技术缺陷，极大限制了口腔念珠菌病的临床治疗效果。如下：（1）现有广谱抗真菌药物的长期滥用，导致白色念珠菌耐药性持续升高，传统药物抑菌杀菌效果大幅下降，临床治疗有效率显著降低。（2）现有筛选体系获得的抗真菌药物普遍存在明显的临床使用局限性，不仅存在全身毒副作用，还易与其他临床药物产生交叉反应，用药安全性较差。再次，目前临床可用的抗真菌药物品类稀缺，可选治疗药物体系单一，难以满足复杂、耐药性口腔念珠菌感染的个体化治疗需求。（3）现有药物筛选多以直接杀灭、抑制真菌增殖为核心思路，缺乏毒力靶向调控的新型筛选策略，未针对白色念珠菌特异性致病靶点开展精准筛选，无法从根源上规避真菌耐药性与药物毒副作用问题。其中，白色念珠菌v-atpase v0c'亚基为真菌特有靶点，人体内无同源蛋白，是极具潜力的新型抗真菌靶点，但目前尚无基于该特异性靶点、通过抑制真菌毒力实现抗感染的药物筛选体系。综上，现有技术靶点单一、筛选模式传统、药物品类匮乏且用药风险高，亟需开发一种靶向白色念珠菌特有毒力靶点的新型药物筛选方法，丰富口腔念珠菌病治疗靶点与药物种类，突破现有临床治疗瓶颈。

技术实现思路

1、本发明意在提供一种靶向白色念珠菌v-atpase v0c'亚基以抑制其毒力的药物的筛选方法及其应用，以解决现有筛选体系所得药物对耐药型白色念珠菌的临床治疗有效率偏低的技术问题。

2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种靶向白色念珠菌v-atpase v0c'亚基以抑制其毒力的药物的筛选方法，包括如下步骤：

3、步骤s1、解构与初筛：通过pubchem查询v0c' 的蛋白质序列，用 alphafold2 对其蛋白质进行结构预测，并在软件quickvina 2.1 上虚拟筛选能与该蛋白质结合的小分子化合物；

4、步骤s2、氨基酸精细对接：将初筛后的化合物在软件 quickvina 2.1上与v0c'亚基进行精细对接；根据精细对接结果，再结合模式分析与分子筛选，获得理想的筛选药物；

5、步骤s3、验证：通过实验验证所得药物对白色念珠菌体内外毒力的抑制效果。

6、有益效果：本筛选方法围绕白色念珠菌毒力关键靶点v-atpase v0c'亚基，构建了“结构预测-虚拟初筛-关键氨基酸精细对接-表型与分子机制验证”的层级式精准药物筛选体系，突破传统广谱抗真菌筛选盲目性高、脱靶率大、易诱导耐药的缺陷，具备靶点明确、筛选效率高、结合特异性强、结果可靠性足的显著优势，可高效获得靶向抑制白色念珠菌毒力的候选药物，为新型抗真菌毒力抑制剂开发提供精准、标准化的筛选技术体系。具体有如下优势：

7、1. 靶点精准明确，筛选靶向性极强。本方法锁定白色念珠菌毒力调控核心v-atpase v0c'亚基为专属靶点，区别于传统抗真菌药物筛选以杀菌、抑菌为单一评价标准的模式，以抑制真菌毒力为核心筛选目标，可有效规避传统抗菌药物易诱导真菌耐药、破坏机体正常菌群的弊端，筛选获得的候选药物安全性更高、耐药风险更低，适配新型抗真菌靶向药物的研发需求。

8、2. 依托人工智能结构预测，解决靶点结构缺失难题。通过pubchem获取蛋白序列、结合alphafold2完成蛋白质高级结构精准预测，突破了部分真菌靶蛋白晶体结构未解析、无法开展分子对接筛选的技术瓶颈，无需依赖昂贵、复杂的蛋白结晶实验，即可实现靶点结构的精准建模，大幅降低前期实验成本，缩短药物筛选前期筹备周期。

9、3. 层级化虚拟筛选体系，筛选效率与精准度双提升。采用“广谱虚拟初筛+关键氨基酸精细对接”两级筛选模式，先通过quickvina 2.1完成大批量小分子化合物初筛，快速剔除无结合活性的无效化合物，缩减筛选样本量；再针对v0c'亚基关键氨基酸位点进行精准对接验证，从结合位点、结合能力层面锁定高活性候选药物，大幅降低假阳性率，解决传统筛选方法筛选量大、有效命中率低的问题。

10、4. 表型结合分子机制双层验证，筛选结果可靠性高。本方法在虚拟筛选基础上，增设真菌表型功能验证与细胞层面分子机制探究，将计算机虚拟结合数据与真实生物活性、细胞作用机制相互佐证，杜绝单纯分子对接的数据偏差，明确候选药物抑制白色念珠菌毒力的作用机理，使筛选结果更严谨、可信，为后续药物开发与临床转化提供坚实的实验与理论支撑。

11、优选的，作为一种改进，所得理想的筛选药物为n026，结构式如下：

12、。

13、优选的，作为一种改进，在步骤s1中，所述虚拟筛选包括如下内容：使用无配体的空蛋白结构，设定大范围对接盒子，参数为：中心坐标 center_x = 9.588, center_y =1.565, center_z = 12.527；盒子尺寸 size_x = 42.0, size_y = 42.0, size_z =46.0；根据对接打分排序，选取排名前100的小分子进入下一阶段。

14、优选的，作为一种改进，在步骤s2中，所述精细对接时，针对初筛排名前列的分子，将对接盒子大幅缩小，仅包裹vma11蛋白的核心结合口袋残基。

15、优选的，作为一种改进，在步骤s2中，精细对接筛选所得小分子的同源模建蛋白与模板蛋白的关键相互作用氨基酸之间的结合能≤-7.5 kcal/mol。

16、优选的，作为一种改进，在步骤s2中，所述结合模式分析与分子筛选包括将经过精细对接后打分低于-7.5 kcal/mol的化合物提取出来后，利用pymol、discovery studio(ds) 可视化软件进行三维构象与相互作用分析。

17、优选的，作为一种改进，所述三维构象与相互作用分析包括（1）空间位置核验，限定小分子的结合构象必须位于c'亚基的正确结合口袋内，剔除由于分子体积过小导致结合位点发生偏移的假阳性分子；（2）相互作用验证：候选小分子必须与靶标蛋白的关键残基形成强烈的疏水相互作用。

18、优选的，作为一种改进，所得关键残基包括ala 107、ser 114、phe 142、ala 143、leu 146、val 145、tyr 149、ile 153。

19、优选的，作为一种改进，本方案还提供一种药物n026在制备治疗口腔念珠菌病、免疫低下患者的急性假膜型念珠菌病、治疗义齿相关念珠菌感染或义齿表面生物膜清除中任一项的药物中的应用。

20、优选的，作为一种改进，本方案还提供一种药物n026在制备龋病防治的药物中的应用。

21、本方案的原理及优点是：

22、本方案虚拟筛选所得药物id为n026-0090(后简称n026)能够有效下调白色念珠菌的菌丝、生物膜形成以及粘附能力，从而抑制其毒力性状。具体的，当将药物n026与白色念珠菌野生型及其氟康唑耐药株和敏感株共培养24h后，在显微镜观察下发现菌丝形成的长度相比对照组有显著减少。通过结晶紫实验对其生物膜形成进行测定显示，n026能够显著减少野生型白色念珠菌的生物膜形成，对其耐药株的生物膜形成量也有一定抑制作用。并且在细胞粘附实验中测定n026作用后的白色念珠菌对口腔黏膜上皮细胞进行共培养后发现，n026能够显著抑制白色念珠菌对口腔黏膜上皮粘附的能力。