一种脂质体疫苗及其制备方法与应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种脂质体疫苗及其制备方法与应用。

背景技术：

1、肿瘤免疫治疗通过激活机体自身免疫系统特异性杀伤肿瘤细胞，已成为恶性肿瘤防治领域的研究热点。肿瘤疫苗作为主动性免疫治疗手段，可递送肿瘤抗原诱导机体产生特异性t细胞应答，但单一抗原免疫原性较弱，难以激发强效、持久的抗肿瘤免疫反应，通常需搭配免疫佐剂协同增强免疫应答。

2、现有单一靶点佐剂仅能激活单一免疫通路，免疫激活效果有限。其中sting激动剂可激活树突状细胞分泌促炎因子，启动固有免疫；inkt细胞激动剂能够快速活化inkt细胞，同步调控固有免疫与适应性免疫，两类佐剂作用通路互补，但游离佐剂体内易被酶降解、全身分布易引发系统性毒副作用，限制其临床应用。

3、脂质体纳米载体具备生物相容性好、可共包封多种活性物质、靶向递送等优势，是抗原与佐剂的优良递送载体。现有脂质体肿瘤疫苗多仅负载单一佐剂，缺乏同时搭载sting激动剂与inkt激动剂的双佐剂共递送体系；常规脂质体制备工艺所得颗粒粒径不均一，游离抗原残留量大，易造成免疫效率下降、副反应升高。

4、目前临床上仍缺少可同步激活双免疫通路、粒径可控、纯度高的双佐剂共载脂质体肿瘤疫苗，因此开发一种共包封inkt细胞激动剂、sting受体激动剂与肿瘤抗原的均质脂质体疫苗及其标准化制备工艺，对提升肿瘤疫苗免疫效力、拓展恶性肿瘤治疗手段具有重要临床价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有肿瘤疫苗免疫原性不足、单一佐剂免疫激活通路单一、游离免疫激动剂体内稳定性差、普通脂质体粒径不均一、游离抗原杂质较多等缺陷，提供一种共载inkt细胞激动剂与sting受体激动剂的脂质体疫苗，同时提供该疫苗标准化制备方法及其抗肿瘤药用用途。本发明将两类通路互补的免疫佐剂与抗原共包封于脂质体载体中，同步激活双重免疫通路，提升机体抗肿瘤免疫应答强度；通过薄膜水化-分级挤出联合透析纯化工艺，实现脂质体粒径精准可控、产物纯度高，降低全身毒副作用，适用于多种实体瘤与血液肿瘤的预防及治疗。

2、为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种脂质体疫苗，所述脂质体疫苗包括抗原、佐剂与脂质组分；所述佐剂包含inkt细胞激动剂和sting受体激动剂。

4、本发明将两类免疫通路互补的佐剂与抗原共同包封于脂质体载体中，通过同步激活固有免疫与适应性免疫双重通路，能够显著提升机体抗肿瘤免疫应答强度。

5、优选地，所述inkt细胞激动剂为krn7000、7dw8-5中的至少一种，或为krn7000、7dw8-5各自的立体异构体、药用盐、水合物、溶剂化物中的至少一种。

6、所述krn7000和7dw8-5的通式分别如（ⅰ）所示：

7、

8、（ⅰ）。

9、优选地，所述sting受体激动剂为dmxaa、c-di-gmp、c-di-amp、diabzi中的至少一种，或为dmxaa、c-di-gmp、c-di-amp、diabzi各自的立体异构体、药用盐、水合物、溶剂化物中的至少一种。

10、所述dmxaa、c-di-gmp、c-di-amp、diabzi的通式分别如（ⅱ）所示：

11、

12、（ⅱ）。

13、更优选地，所述inkt细胞激动剂为krn7000，所述sting受体激动剂为dmxaa。

14、优选地，所述inkt细胞激动剂和sting受体激动剂的质量比为（0.5~1.5）:1。

15、优选地，所述脂质成分包括sm-102、dspc（1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱）、胆固醇和dspe-peg2000。

16、上述四种脂质组分共同构成了脂质体载体骨架，其中sm-102作为可电离阳离子脂质有助于活性物质的包封与胞内递送，dspc提供膜结构稳定性，胆固醇调节膜流动性，dspe-peg2000赋予脂质体长循环性能并减少非特异性蛋白吸附。

17、优选地，所述sm-102、dspc、胆固醇与dspe-peg2000的摩尔比为（40~60）:（5~20）:（30~50）:（1~3）。

18、更优选地，所述sm-102、dspc、胆固醇与dspe-peg2000的摩尔比为50:10:38.5:1.5。

19、第二方面，本发明提供了所述的脂质体疫苗的制备方法，包括以下步骤：

20、（1）将inkt细胞激动剂、sting受体激动剂、脂质成分共同溶于有机溶剂，配制得到佐剂混合溶液；

21、（2）对步骤（1）所得佐剂混合溶液减压浓缩，脱除有机溶剂，于容器内壁形成脂质薄膜；

22、（3）向附着脂质薄膜的容器中加入抗原溶液，超声处理使脂质薄膜充分水化剥离，制备得到包封佐剂、负载抗原的脂质体粗颗粒；

23、（4）采用脂质体挤出器对所述脂质体粗颗粒进行分级挤出粒径均一化处理，制得粒径80~200nm的脂质体；

24、（5）将步骤（4）所得脂质体置进行透析，去除未被包封的游离抗原，纯化后得到脂质体纳米混悬液，即为所述脂质体疫苗。

25、优选地，步骤（2）所述减压浓缩的具体工艺为：先采用旋转蒸发仪在40~60℃条件下脱除大部分有机溶剂，再于常温条件下油泵减压干燥6~24h，完全除去残留溶剂，获得干燥脂质薄膜。

26、优选地，步骤（4）所述分级挤出粒径均一化处理的具体流程为：先采用400nm聚碳酸酯膜反复挤压粗颗粒至挤压无阻力，再更换200nm聚碳酸酯膜继续反复挤压至无阻力，得到粒径80~200nm的均质脂质体。

27、优选地，所述有机溶剂选自二氯甲烷、甲醇、氯仿中的一种或多种。

28、第三方面，本发明提供了所述的脂质体疫苗在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

29、优选地，所述肿瘤选自乳腺癌、卵巢癌、肺癌、子宫癌、肝癌、前列腺癌、黑素瘤、肠癌、肾细胞癌、细胞性淋巴癌、胰腺癌、甲状腺癌、脑癌、胃癌和白血病中的一种或多种。

30、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

31、（1）双佐剂协同增效：本发明采用inkt细胞激动剂与sting受体激动剂双佐剂共载设计，两类佐剂的免疫通路互补，可同步激活机体固有免疫与适应性免疫。相较于单一佐剂体系，本发明能够显著增强抗原特异性抗肿瘤免疫应答，克服了现有技术中单一佐剂免疫激活效果有限的缺陷。

32、（2）脂质体载体提升安全性与生物利用度：本发明中脂质体载体可将佐剂与抗原包封于内部，避免活性物质游离后在体内快速降解和全身扩散，有效减轻系统性炎症不良反应并提升生物利用度。

33、（3）粒径精准可控：本发明通过薄膜水化联合分级挤出工艺，精准将脂质体粒径控制在80~200nm。该粒径范围有利于疫苗向淋巴结富集，从而更有效地激活免疫应答。

34、（4）产物纯度高：本发明通过透析处理充分除去游离抗原，减少非特异性免疫干扰，大幅提升产物纯度与疫苗稳定性。

35、（5）工艺成熟、适用性广：本发明中整套薄膜水化联合挤出纯化工艺成熟稳定、操作重复性强，易于规模化放大生产。选用的脂质组分生物相容性良好，具备较高的临床转化价值。同时，该脂质体疫苗能够对多种实体瘤与血液肿瘤实现预防和治疗效果，临床适用场景广泛。