基于生物正交的抗体偶联物及其制备方法、应用

本发明涉及生物医药，具体涉及基于生物正交的抗体偶联物及其制备方法、应用。

背景技术：

1、抗体偶联物在肿瘤诊断与治疗中具有重要应用，例如抗体-药物偶联物（adc）、抗体-核素偶联物（arc）及抗体-荧光探针偶联物等。实现抗体与药物、核素螯合剂、荧光团等效应分子的高效、定点、可控连接是该领域的关键技术。

2、发明人团队在专利cn115925951a中公开了一种双特异性纳米抗体abdb6，其是通过ggggs连接子桥接靶向cd70的纳米抗体rccb6和结合白蛋白的结构域abd035形成的融合蛋白，能够通过结合白蛋白显著延长体内半衰期，同时凭借较小的分子量实现更快的血液清除与更好的肿瘤穿透能力，特别适合作为分子影像探针平台，通过连接18f、64cu、68ga、89zr等核素用于pet/ct诊断成像，或连接177lu等治疗性核素进行靶向放射性核素治疗，实现肿瘤的诊疗一体化。

3、目前，抗体修饰方法主要是利用还原后的半胱氨酸残基或者抗体表面的赖氨酸残基进行随机偶联。由于abdb6的两个二硫键折叠于内部而不易被还原得到巯基，因此专利cn115925951a基于赖氨酸残基，即伯氨基作为偶联位点，连接子采用异硫氰酸苄基（p-scn-bn）或者二苯并环辛炔-n-羟基琥珀酰亚胺酯（dbco-nhs ester）以连接螯合基团如nota或者去铁胺，进而络合放射性核素。

4、但是，abdb6含有十个赖氨酸，连接子的nhs基团或者ncs基团可能与不同位点的伯氨基反应连接，因此产物为不同偶联比和偶联位点的混合物，批间差异大，易影响抗原结合活性。此外，采用的连接子种类单一，且仅能发挥连接的作用，难以对抗体偶联物的性能起到调节和优化效果，一定程度上限制了抗体偶联物的应用场景。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供基于生物正交的抗体偶联物，其在abdb6融合蛋白上连接具有半胱氨酸（cysteine, cys）的偶联短肽得到abdb6-pt融合蛋白，进而利用半胱氨酸还原后得到的巯基定点连接生物正交基团，实现不同批次产物的偶联位点一致性；同时，连接子的一端连接互补反应基团、另一端连接功能基团，不仅能够基于生物正交基团与互补反应基团之间的生物正交反应将功能基团快速、高效、条件温和地连接至abdb6-pt融合蛋白，而且连接子的种类、长度可以灵活选择，以更好地调节抗体偶联物的性能、匹配不同的功能基团，丰富了抗体偶联物的应用场景。

2、本发明通过下述技术方案实现：

3、基于生物正交的抗体偶联物，其结构式为p-b-l-y，式中，p为具有偶联短肽的abdb6融合蛋白，b为环加成产物基团，l为连接子（linker），y为功能基团，所述偶联短肽通过硫醚键连接至所述环加成产物基团；

4、其中，所述环加成产物基团通过连接于偶联短肽上的生物正交基团与连接于连接子上的互补反应基团通过生物正交反应形成。

5、现有的abdb6融合蛋白的两个二硫键位于折叠结构的内部，即使添加还原剂也不易被还原得到巯基。本技术方案中，在现有的abdb6融合蛋白上通过柔性连接肽连接了一段偶联短肽，偶联短肽连接在abdb6融合蛋白的末端，因此位于折叠结构的外部，从而使偶联短肽上的二硫键可以被更好地还原得到两个巯基，进而利用巯基与生物正交前体反应，通过硫醚键定点连接生物正交基团，确保了不同批次的抗体偶联物的偶联位点的一致性。

6、本技术方案中，效应功能基团，例如荧光基团、螯合基团、药物分子等，可以通过连接子连接至abdb6融合蛋白。具体地，连接子一端连接功能基团，另一端连接能够与生物正交基团进行生物正交反应的互补反应基团。例如，生物正交基团可以是四嗪基团，其互补基团可以是亲双烯体，两者通过逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应（iedda）得到哒嗪类环加成产物基团，又例如，生物正交基团可以是叠氮基，其互补基团可以是端位炔基化合物，两者通过铜催化叠氮-炔烃环加成反应（cuaac）得到三氮唑类环加成产物基团。因此，通过生物正交反应，能够将功能基团快速、高效、条件温和地连接至abdb6融合蛋白，并且，通过试验发现，生物正交基团的引入不会影响abdb6与cd70蛋白的亲和力，而abdb6的引入也不会影响生物正交反应的速率。

7、本技术方案中，能够更加灵活地选择连接子的种类、长度，使连接子不仅局限于连接的作用，而是能够积极地发挥调控作用。例如，在部分实施例中，连接子采用peg链时，可以利用peg链的水合作用增加分子亲水性，减少血浆蛋白非特异性吸附，还可以通过屏蔽效应降低肝脏、脾脏等网状内皮系统的摄取，从而改善全身正常器官的背景信号。不仅如此，通过调节连接子的长度，还能够控制靶向配体与受体的空间匹配度，避免过短导致的位阻或过长引起的清除延迟。

8、本技术方案中，抗体偶联物具有以下结构式：

9、

10、或

11、

12、可以看出，abdb6的偶联短肽的半胱氨酸残基通过硫醚键与环加成产物基团连接，式中的半胱氨酸残基属于abdb6的偶联短肽，为了突显硫醚键而将其示出，环加成产物基团通过连接子连接至功能基团，通过选择不同的功能分子，可实现荧光成像、pet成像、核素治疗、药物递送等多种应用。

13、作为本发明的一种优选实施方式，所述生物正交基团为四嗪基团，所述四嗪基团的互补反应基团为亲双烯体或者异腈基；或者所述生物正交基团为叠氮基，所述叠氮基的互补反应基团为端位炔基化合物或者环状炔基化合物。

14、本技术方案中，生物正交基团可以是四嗪基团，对应的互补反应基团可以是亲双烯体，四嗪基团与亲双烯体通过逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应形成环加成产物，例如，亲双烯体可以是双环[6.1.0]壬炔（bcn），两者反应得到哒嗪类环加成反应基团。在一个或多个实施例中，亲双烯体还可以选自能够与四嗪基团进行生物正交反应的其他亲双烯体，例如反式环辛烯（tco）、降冰片烯、环丙烯等。在生物正交基团为四嗪基团时，对应的互补基团还可以是异腈基，异腈基与四嗪基团通过[4+1]环加成反应形成吡唑类环加成产物。在部分优选的实施例中，连接有异腈基的连接子的结构可以是：

15、；

16、式中，基团r3选自h或者c1~c6烷基。

17、本技术方案中，生物正交基团也可以是与偶联短肽间接连接的叠氮基，其对应的互补反应基团可以是端位炔基化合物，利用叠氮基与端位炔基化合物发生cuaac反应得到三氮唑类环加成产物。同时，互补反应基团也可以是环状炔基化合物，例如二苯并环辛炔（dbco），利用叠氮基与环状炔基化合物发生应变促进的叠氮-炔烃环加成反应（spaac）反应得到三氮唑类环加成产物。

18、进一步地，所述abdb6融合蛋白的偶联短肽包括一个或者两个半胱氨酸，所述半胱氨酸在还原后经硫醚键连接至所述环加成产物基团。

19、进一步地，所述具有偶联短肽的abdb6融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1或者seqid no.3所示。

20、进一步地，所述连接子选自一个或多个聚乙二醇单元，c1~c12亚烷基，二价葡萄糖基，c4~c6的芳基或者杂芳基中的至少一种，其中杂芳基的杂原子选自n、o、s。

21、本技术方案中，通过选择不同的连接子，能够调整缀合物的理化性质。在部分实施例中，连接子可以是一个或多个聚乙二醇单元，也即peg链。peg链为亲水柔性链，其通过增加水合半径和减少血浆蛋白吸附，将药物从快速肾清除调整为适度延长循环，而不致过度蓄积，从而提升肿瘤累积暴露剂量。同时，peg链的亲水屏蔽层抑制肝、脾网状内皮系统的捕获，中性电荷避免肾小管电荷介导的重吸收，代谢产物维持高水溶性实现快速排泄。

22、在一个或多个实施例中，peg链中的n=1~12。在部分优选的实施例中，n=4~8，通过调整合适的peg链长度，不仅能够避免peg链过短导致的空间位阻和亲和力下降，也防止了peg链过长引起的正常组织清除延迟。

23、本技术方案中，除了peg链，连接子还可以选择作为疏水链的亚烷基。在一个或多个实施例中，连接子可以是c1~c12亚烷基。在部分实施例中，连接子可以是亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基。此外，连接子还可以是亲水刚性糖环，例如二价葡萄糖基。在一个或多个实施例中，连接子可以是葡萄糖-1,6-二基或者葡萄糖-1,4-二基。在部分实施例中，连接子还可以是c4~c6的芳基或者杂芳基，在一个或多个实施例中，连接子可以是苯基、哌啶基、哌嗪基、噻吩基、吡啶基、吡咯基等。

24、进一步地，所述功能基团为荧光基团、络合有放射性核素的螯合基团、或者药物分子；其中，所述荧光基团选自花菁类荧光染料或者磺化花菁类荧光染料；所述螯合基团选自dota、nota、nodaga、pcta、macropa、pyta、teta、dotma、dtpa、hbed-cc、bispidine、hopo、dfo、trap中的任一种，所述放射性核素为68ga、89zr、64cu、124i、177lu、90y、或225ac；所述药物分子选自喹啉类生物碱，蒽环类抗生素，或者肽类药物。

25、在部分实施例中，荧光基团可以选自花菁类荧光染料，例如cy3、cy5、cy7等cy系列花菁染料。在一个或多个实施例中，荧光基团也可以选自磺化花菁类荧光染料，例如alexafluor 647、dylight 650、atto 647n或irdye 680rd中的至少一种。

26、在部分实施例中，螯合基团可以选自dota（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）、nota（1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸）、nodaga（1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸-戊二酸）、pcta（1,4,7,10-四氮杂环十一烷-1,4,7-三乙酸）、macropa、pyta、teta（1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸）、dotma（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸四甲基衍生物）等大环类螯合剂。在部分实施例中，螯合基团也可以是一些非大环螯合剂，例如线性氨羧络合剂dtpa（二乙烯三胺五乙酸）、hbed-cc（n,n'-双(2-羟基苄基)乙二胺-n,n'-二乙酸-环己烷羧酸）、双环[3.3.1]壬烷类螯合剂bispidine、八齿螯合剂hopo、三羟肟酸类铁螯合剂dfo、三羟基膦酰基丙酸类螯合剂trap等。

27、在一个或多个实施例中，放射性核素可以是用于诊断显像的68ga、89zr、64cu、124i等放射性核素。又例如，在一个或多个实施例中，放射性核素可以是用于抗肿瘤治疗的177lu、90y、225ac等放射性核素。在部分优选的实施例中，基于诊断或治疗目的，放射性可以选择68ga/177lu、68ga/225ac、89zr/177lu、89zr/225ac等诊疗对。

28、在部分实施例中，药物分子可以选自喹啉类生物碱，例如喜树碱、鸭嘴花碱、青藤碱等；药物分子也可以选自蒽环类抗生素，例如多柔比星、表柔比星、吡柔比星等；药物分子还可以选自肽类药物，例如mmae、奥曲肽、亮丙瑞林等。

29、本发明的另一个目的在于提供一种基于生物正交的抗体偶联物的制备方法，该方法以具有偶联短肽的abdb6-pt融合蛋白为原料，将生物正交前体与偶联短肽中还原的巯基进行反应，形成具有一个或者两个硫醚键的硫醚键中间体，硫醚键中间体进一步通过与连接有互补反应基团和功能基团的连接子进行生物正交反应得到抗体偶联物，有效地克服了现有技术中abdb6的修饰难题，并可以通过连接子灵活地连接荧光探针、络合有核素的螯合基团，具有广泛的应用价值。

30、本技术方案中，基于生物正交的抗体偶联物的制备方法，具体包括以下步骤：

31、向具有偶联短肽的abdb6融合蛋白中加入还原剂，制得还原态abdb6融合蛋白，其中，所述偶联短肽包括一个或者两个半胱氨酸；

32、所述还原态abdb6融合蛋白与生物正交前体反应得到硫醚键中间体，所述硫醚键中间体具有生物正交基团，所述生物正交基团通过硫醚键连接至所述偶联短肽；

33、所述硫醚键中间体的生物正交基团与连接子的第一端的互补反应基团发生生物正交反应形成环加成产物基团，连接子的第二端连接有功能基团。

34、进一步地，所述生物正交前体为3,6-二乙烯基-1,2,4,5-四嗪或者3位或6位连接有乙烯基的单乙烯基四嗪，所述硫醚键中间体的生物正交基团为四嗪基团，所述四嗪基团的互补反应基团为亲双烯体或者异腈基；或者

35、所述生物正交前体为1,1'-[5-(叠氮甲基)-1,3-亚苯基]双(2-碘乙烷-1-酮)，所述硫醚键中间体的生物正交基团为叠氮基，所述叠氮基的互补反应基团为端位炔基化合物或者环状炔基化合物。

36、本发明的又一个目的在于提供前述任一种基于生物正交的抗体偶联物在制备诊断或者治疗分子中的应用。例如，当功能基团为荧光基团时，抗体偶联物可以利用abdb6靶向肿瘤细胞后进行显影，作为制备肿瘤显影剂的活性物质；当功能基团为药物分子时，抗体偶联物能够作为抗肿瘤药物的活性物质；同样地，当功能基团为络合有核素的螯合基团时，抗体偶联物既可以实现肿瘤的诊断，也可以实现肿瘤的治疗。

37、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

38、1、本发明通过在abdb6融合蛋白的末端连接具有二硫键的偶联短肽，使得二硫键在还原后能够定点连接生物正交基团，再利用生物正交反应去连接功能基团，确保了不同批次产物的偶联位点一致性；

39、2、本发明利用生物正交反应连接abdb6融合蛋白上的生物正交基团和连接子一端的互补反应基团，能够将功能基团快速、高效、条件温和地连接至abdb6融合蛋白；

40、3、本发明中，连接子的种类、长度可以灵活选择，以更好地调节抗体偶联物的性能、匹配不同的功能基团，丰富了抗体偶联物的应用场景。