糖工程化抗体偶联药物及其制备方法

本发明属于生物医药，更具体地，涉及一种糖工程化抗体偶联药物及其制备方法，制备方法是通过对抗体fc段n-糖链进行工程化改造来增强抗体偶联药物（antibody-drug conjugate，adc）溶酶体加工效率，通过该方法可进一步制备得到的糖工程化adc、相关药物组合物，并由此可获得一种候选抗体筛选方法。

背景技术：

1、抗体偶联药物通过将高特异性抗体与细胞毒性有效载荷经连接子偶联，实现对肿瘤细胞的靶向杀伤。对于采用可裂解肽连接子的adc，例如trastuzumab deruxtecan（t-dxd）和datopotamab deruxtecan（dato-dxd），其发挥抗肿瘤作用依赖于adc进入肿瘤细胞后在溶酶体中被蛋白酶有效加工和切割，从而释放细胞毒性有效载荷。

2、然而，临床实践中仍有相当比例患者对adc治疗表现出原发性或获得性耐药。既往关于adc耐药的研究主要集中于靶抗原表达下调、受体介导内吞障碍、药物外排泵过表达以及有效载荷代谢或敏感性改变等方面。这些机制可解释部分特定adc的耐药，但对于依赖溶酶体蛋白水解切割的不同靶点adc，其共同的溶酶体加工限制仍缺乏可直接干预的制备策略。

3、已有研究提示，肿瘤细胞代谢重编程能够改变溶酶体环境；但是，现有技术尚未阐明异常糖原结构是否可直接限制采用可裂解肽连接子的adc在溶酶体内的加工和有效载荷释放，也未提出通过改变抗体fc段n-糖链结构来降低adc与糖原凝聚体相互作用的技术方案。

4、抗体fc段n-糖链是抗体的重要翻译后修饰，其糖基化模式包括岩藻糖化、半乳糖化和唾液酸化等，能够影响抗体效应功能、半衰期、组织分布、fc受体结合和补体激活等。然而，现有技术尚未明确fc糖基化修饰是否影响adc在溶酶体糖原凝聚体中的分配行为，也未提出通过调控fc段n-糖链唾液酸化来提高adc溶酶体加工效率的制备策略。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种糖工程化抗体偶联药物及其制备方法。通过提高抗体fc段n-糖链的唾液酸化水平，使所得adc相对于相应未改造对照adc在糖原凝聚体中的分配降低，并提高溶酶体加工、有效载荷释放和抗肿瘤活性。

2、为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供一种糖工程化抗体偶联药物的制备方法，包括以下步骤：

3、（1）准备抗体；

4、（2）对所述抗体的fc段n-糖链进行工程化改造，使抗体具有增强的唾液酸化修饰，得到糖工程化抗体；

5、（3）将步骤（2）获得的糖工程化抗体与连接子和细胞毒性有效载荷偶联，得到糖工程化抗体偶联药物。

6、作为本发明的进一步优选，步骤（2）中，对所述抗体的fc段n-糖链进行工程化改造，具体包括：

7、(i)过表达唾液酸转移酶；

8、以及可选的(ii)进一步过表达半乳糖转移酶和/或敲除岩藻糖转移酶；

9、从而使所述抗体的fc段n-糖链的唾液酸化水平提高；

10、其中，所述增强的唾液酸化修饰包括α2,6-连接唾液酸和/或α2,3-连接唾液酸水平提高；

11、所述增强，是指与除未实施步骤（2）的相应糖工程化改造外、抗体氨基酸序列及其他制备条件相同的对照抗体相比，相应唾液酸化水平提高。

12、作为本发明的进一步优选，所述抗体表达宿主细胞为中国仓鼠卵巢（cho）细胞；

13、所述唾液酸转移酶包括st6gal1和/或st3gal4；

14、所述半乳糖转移酶包括b4galt1；

15、所述岩藻糖转移酶包括fut8。

16、作为本发明的进一步优选，步骤（1）中，所述抗体能够靶向her2或trop2；优选地，所述抗体为trastuzumab或datopotamab；

17、步骤（3）中，所述连接子为可裂解肽连接子；优选地，所述连接子为ggfg连接子；

18、所述细胞毒性有效载荷为deruxtecan（dxd）或其衍生物。

19、按照本发明的另一方面，提供利用上述制备方法制得的糖工程化抗体偶联药物。

20、按照本发明的再一方面，提供利用上述糖工程化抗体偶联药物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

21、作为本发明的进一步优选，所述肿瘤为her2阳性乳腺癌或trop2阳性乳腺癌。

22、按照本发明的又一方面，提供一种筛选具有提高的溶酶体加工效率的糖工程化候选抗体偶联药物的方法，包括以下步骤：

23、s1：提供候选糖工程化抗体及其相应的未改造对照抗体；

24、s2：在相同条件下检测所述候选糖工程化抗体和所述未改造对照抗体在糖原凝聚体中的分配系数；

25、s3：选择分配系数低于所述未改造对照抗体的候选糖工程化抗体作为预选抗体；

26、s4：将所述预选抗体和所述未改造对照抗体分别与相同的可裂解肽连接子及细胞毒性有效载荷偶联，得到候选抗体偶联药物和相应的未改造对照抗体偶联药物。

27、作为本发明的进一步优选，步骤s2中，将等量荧光标记的候选糖工程化抗体和未改造对照抗体这2种抗体分别与糖原在相同体外相分离条件下混合，定量凝聚体相和稀释相中每1种抗体的荧光强度，并以下公式计算每1种抗体的分配系数；

28、分配系数 = 凝聚体相荧光强度/稀释相荧光强度。

29、本发明所述增强的唾液酸化修饰可通过sambucus nigra凝集素检测α2,6-连接唾液酸和/或通过maackia amurensis凝集素ii检测α2,3-连接唾液酸，并可通过n-糖链色谱分析进一步确认。

30、通过本发明所构思的技术方案，可在不改变adc靶抗原、连接子类型和有效载荷种类的条件下，通过优化抗体fc段n-糖链来降低adc被糖原凝聚体捕获，增强溶酶体加工和有效载荷释放。本发明尤其适用于依赖溶酶体蛋白水解切割的可裂解肽连接子adc，例如her2靶向adc和trop2靶向adc。

31、本发明人通过系统比较完整去糖基化、单基因糖工程化和多重糖工程化策略，发现提高抗体fc段n-糖链的唾液酸化水平能够降低adc在糖原凝聚体中的分配。其中，st6gal1介导的唾液酸化表现出一致作用，b4galt1和st6gal1联合过表达产生的糖工程化adc在所比较方案中表现出更强的凝聚体排斥和肿瘤细胞杀伤活性。该改变同时伴随lysolight报告信号增强，支持溶酶体加工和连接子切割提高。

32、与相应未改造对照adc相比，本发明得到的糖工程化adc的抗体fc段n-糖链具有提高的唾液酸化水平，在糖原凝聚体中的分配降低，并表现出增强的溶酶体加工、有效载荷释放和抗肿瘤活性（其中，相应未改造对照adc，除未实施相应糖工程化改造外，抗体氨基酸序列、连接子、有效载荷及其他制备和检测条件均与糖工程化adc相同；提高的唾液酸化水平，是指与对照抗体相比相应唾液酸化水平提高；对照抗体是指除了未实施相应糖工程化改造外，抗体氨基酸序列及其他制备条件均相同）。

33、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

34、（1）提出通过提高抗体fc段n-糖链唾液酸化水平来调控adc在糖原凝聚体中的分配行为，为提高可裂解肽连接子adc的溶酶体加工效率提供新的糖工程化策略。

35、（2）本发明制备的糖工程化adc可减少被糖原凝聚体捕获，提高lysolight报告信号和有效载荷释放，并增强肿瘤细胞杀伤活性。

36、（3）本发明不依赖于改变adc靶抗原、连接子或有效载荷本身，而是通过抗体糖链工程化提高adc在肿瘤细胞内的加工效率，具有平台化应用潜力。

37、（4）本发明的技术效果已在her2靶向adc和trop2靶向adc模型中得到验证，表明该策略可适用于不同靶抗原的可裂解肽连接子adc。

38、（5）本发明提供的筛选方法以相应未改造adc为直接对照，结合糖原凝聚体分配、溶酶体加工、有效载荷释放和细胞毒性进行分层验证，可用于筛选具有提高的溶酶体加工效率的糖工程化adc候选物。