一种具有膜蛋白降解功能的抗体药物偶联物及其构建方法和在制备抗肿瘤药物中的应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种具有膜蛋白降解功能的抗体药物偶联物及其构建方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

1、抗体药物偶联物(antibody drug conjugate，adc)作为现代肿瘤治疗的里程碑，将抗体的靶向性与化疗药物的高效杀伤性完美结合，开辟了肿瘤靶向治疗的新时代。目前已上市的adc药物有16种，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、结直肠癌等众多肿瘤的治疗中表现出优异的临床疗效，赢得了患者与市场的广泛认可。对于adc药物而言，理想的抗原靶点应具备两大关键特性：其一，在肿瘤细胞表面高表达，而在正常组织不表达或极少表达，以确保药物的特异性，其二，具有高内吞效率，因为抗原的内吞效率直接决定了adc药物被肿瘤细胞摄取的能力以及细胞毒素的释放效率，快速内化不仅能够减少毒素非靶向释放，降低对正常组织的损伤，还能显著提高adc药物的疗效和安全性，例如：her2和trop2等抗原就因其显著的内吞作用，成为adc药物开发的优选靶点。然而，并不是所有抗原靶点都可以快速内化，而且每种抗体-抗原配对的内吞效率存在差异，这就要求在adc药物开发中，必须对抗体和抗原靶点进行严格筛选和评估。尽管科学家们已经发现了多种在肿瘤细胞表面高表达的抗原，但这些抗原的内吞效率不足，导致adc药物与靶抗原结合后内吞效率低、细胞毒素释放量少、抗肿瘤效果不佳，这些问题成为制约针对这些靶点adc药物研发的关键瓶颈。

2、与胞内蛋白相比，位于细胞膜上的蛋白靶标具有良好的药物可及性，成为了一类非常重要的药物靶点。近年来，多种新型膜蛋白靶向降解技术迅速兴起，为药物研发领域带来了新的机遇。这些技术巧妙地利用了细胞固有的“内吞转运”途径，通过设计特定的双功能嵌合体或纳米抗体-多肽偶联物，实现了对细胞膜蛋白的靶向降解。例如，2020年斯坦福大学的bertozzi教授团队研发的溶酶体靶向嵌合体lytacs(lysosome targetingchimaeras)，能够利用溶酶体转运受体(ltr)介导的内吞作用，将靶蛋白劫持到溶酶体进行降解。类似地，protabs、kinetacs、apt-lytac等一系列技术也应运而生，它们通过不同的机制促进了膜蛋白靶标的内化和溶酶体降解。此外，本团队还首次利用细胞自噬机制开发了一种全新的膜蛋白降解策略(autab)。这种策略通过抗体偶联自噬诱导分子pei，诱发细胞自噬，成功实现了多个疾病相关膜蛋白的内化和溶酶体降解。这些基于内吞-溶酶体途径和自噬-溶酶体途径的研究不仅为细胞膜蛋白的靶向降解提供了新方法，也为adc药物研发中如何促进细胞膜表面抗原的内化提供了新思路。

3、细胞穿膜肽(cell-penetrating peptide,cpp)是一类由5～30个氨基酸组成的短链多肽，能够高效穿透细胞膜并携带外源性大分子物质蛋白质、核酸、药物等进入细胞。在前期的研究中，申请人利用cpp介导的內吞作用，开发了一种基于cpp与小分子偶联结构的蛋白质靶向降解(cpptac)策略，在不依赖细胞表面特定ltr的情况下，成功实现了多种细胞膜蛋白的溶酶体靶向降解(中国专利，cn202410150710.6)；蔡晓青等人通过分选酶介导的连接，在egfr纳米抗体的c末端偶联含有溶酶体分选npgy(asn-pro-gly-tyr)基序和/或穿膜肽arg9的多肽，显著增强了网格蛋白介导的内吞作用，提高了纳米抗体-药物偶联物的抗肿瘤活性(“protein labeling approach to improve lysosomal targeting andefficacy ofantibody–drug conjugates”，ying han,yifan da,mingjiayu,yapingcheng,xin wang,jiale xiong,guoying guo,yan li,xianxing jiang and xiaoqingcai,org.biomol.chem.,2020,18,3229)，然而，此类adc药物中穿膜序列是直接表达在抗体或纳米抗体上的，抗体的表达与纯化过程复杂且耗时，且adc药物的最终质量受限于抗体的表达量、纯度和活性。

技术实现思路

1、针对adc药物的制备受限于靶点自身內吞效率不足，导致抗体与靶抗原结合后内吞效率低、细胞毒素释放量少、抗肿瘤效果不佳等问题，限制了其应用的技术现状，本发明旨在提供一种具有膜蛋白降解功能的抗体药物偶联物及其构建方法和抗肿瘤的制药应用。本发明通过在抗体上化学偶联穿膜肽cpp和细胞毒素分子，得到的adc药物能够高效结合肿瘤细胞表面的抗原靶标，从而促进抗原靶标的高效內吞，并进入溶酶体中发生降解，同时所携带的细胞毒素在溶酶体中被释放出来，进入细胞质结合自己的靶标，导致肿瘤细胞的死亡或凋亡，为adc药物的研发提供一种通用的策略，尤其是对于在肿瘤细胞上高表达但不具有高內吞效率的抗原靶标，通过偶联cpp能显著增加adc的內吞效率，从而产生显著的抗肿瘤治疗效果。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明提供一种具有膜蛋白降解功能的抗体药物偶联物，该抗体药物偶联物包括抗体、细胞穿膜肽和细胞毒素，所述抗体经还原通过化学偶联与细胞穿膜肽和细胞毒素连接；

4、所述抗体为靶向肿瘤相关抗原的单克隆抗体或双特异性抗体；

5、所述细胞穿膜肽为具有穿膜能力的多肽或包含该多肽序列的衍生物；

6、所述细胞毒素为带有溶酶体水解酶响应切割型linker的小分子、多肽或拟肽类化合物。

7、所述靶向肿瘤相关抗原为靶向乳腺癌、膀胱癌、肺癌、结直肠癌、骨髓瘤、急性白血病和淋巴瘤中任意一种肿瘤中高表达的相关抗原。

8、进一步地，所述靶向肿瘤相关抗原为egfr、pd-l1、her2、ctla-4、lag-3、vegfr、cd20、cd19、cd38、bcma、cea、claudin 18.2、trop2、c-met、dll3、b7-h3、nectin-4、rankl和frα中的任意一种。

9、更进一步地，所述靶向肿瘤相关抗原为egfr、pd-l1和her2中的人任意一种。

10、所述细胞穿膜肽为penetratin、r8、r9、tat、hiv-tat、map、cady、ptd-5、cppp-2、yta4、yta2,4、m918、tp10、mpg、vp22、pvec和pep-1中的任意一种。

11、进一步地，所述细胞穿膜肽通过修饰基团与抗体化学偶联，所述基团选自马来酰亚胺基团、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、乙烯基砜基团或环氧基团中的任意一种或多种的组合。

12、所述细胞穿膜肽还包含聚乙二醇链、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、多糖类聚合物和聚乙烯吡咯烷酮中的任意一种或组合。

13、所述细胞毒素通过修饰基团与抗体化学偶联，所述基团选自马来酰亚胺基团、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、乙烯基砜基团或环氧基团中的任意一种或多种的组合。

14、进一步地，所述细胞毒素为mmae或dxd。

15、更进一步地，所述抗体药物偶联物为靶向egfr的ctx-cpp-mmae或ctx-cpp-dxd。

16、本发明提供上述具有膜蛋白降解功能的抗体药物偶联物的构建方法，包括：

17、使用还原剂还原抗体，获得还原后的抗体；

18、将还原后的抗体化学偶联细胞穿膜肽和细胞毒素；

19、偶联反应结束后，淬灭反应，洗涤，超滤获得具有膜蛋白降解功能的抗体药物偶联物；

20、所述还原剂为三(2-羧乙基)膦、巯基乙醇和二硫苏糖醇中的任意一种。

21、进一步地，所述将还原后的抗体化学偶联细胞穿膜肽和细胞毒素，所述化学偶联为依次化学偶联或者同时化学偶联。

22、更进一步地，所述还原后的抗体依次化学偶联细胞穿膜肽和细胞毒素，具体包括：将还原后的抗体与细胞穿膜肽偶联，获得偶联细胞穿膜肽抗体，使用还原剂还原偶联细胞穿膜肽抗体，将还原后的偶联细胞穿膜肽抗体与细胞毒素偶联。

23、本发明提供一种药物，所述药物物由上述的具有膜蛋白降解功能的抗体药物偶联物添加或不添加药学上可接受的赋形剂或载体构成。

24、本发明提供上述具有膜蛋白降解功能的抗体药物偶联物或上述药物在制备抗肿瘤药物中的用途。

25、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

26、本发明提供的具有膜蛋白降解功能的抗体药物偶联物(adc)，该adc通过创新性的结构设计，在抗体上同时化学偶联穿膜肽(cpp)和细胞毒素分子，利用单克隆抗体特异性识别并结合肿瘤细胞表面的相关抗原，实现了对肿瘤细胞的精准定位，确保了药物能够直接作用于肿瘤细胞，减少了对正常细胞的损伤，具有精准靶向与高效递送；单克隆抗体与肿瘤细胞表面的抗原靶标结合后，在cpp的作用下启动细胞的內吞作用，使得抗原靶标连同结合的adc被细胞摄取，并经内体进入溶酶体，随后在溶酶体内，抗原靶标被降解，而adc中细胞毒素的连接子在溶酶体水解酶(如组织蛋白酶b，ctb)作用下断裂，从而释放细胞毒素，确保了药物在肿瘤细胞内部发挥作用，提高了药物的疗效；本发明具有膜蛋白降解功能的抗体药物偶联物通过其独特的设计机制，实现了对肿瘤细胞的精准靶向、高效递送以及双重抗肿瘤效果的提升，为肿瘤治疗领域提供了一种新的、具有潜力的治疗策略。

27、进一步地，以egfr(表皮生长因子受体)作为抗原靶标，使用egfr单抗西妥昔单抗(cetuximab,ctx)作为adc药物设计的前体分子，通过在ctx上分步偶联细胞穿膜肽和细胞毒素(mmae或dxd)，构建的新型adc药物，具有以下显著优势：(1)egfr降解功能，不仅能够特异性结合egfr，还具备降解egfr整体蛋白的能力，使得该药物能够有效抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，同时降低因egfr突变导致的耐药性，为克服肿瘤治疗中的耐药问题提供了新的策略；(2)高效内吞与细胞杀伤功能，通过偶联cpp，该adc药物显著提高了内吞效率，能够将更多的细胞毒素精准投递到肿瘤细胞内部，得药物在肿瘤部位的浓度大幅提升，从而产生更强的细胞杀伤效果。高内吞效率与高效细胞毒素释放的协同作用，确保了药物对肿瘤细胞的强效打击。可见，本发明中adc药物的作用机制如下：adc药物首先结合肿瘤细胞表面高表达的egfr，随后在cpp的介导下启动细胞内吞作用。抗体药物偶联物经由内体进入溶酶体，在溶酶体的酸性环境中发生酶解，释放出所携带的细胞毒素分子(mmae或dxd)。这些细胞毒素分子进入细胞质后，与其作用靶标结合，最终导致肿瘤细胞的凋亡或死亡。此外，细胞毒素自身所具备的“旁观者杀伤”效应，能够进一步杀灭周边的肿瘤细胞，增强整体治疗效果。这种adc药物设计有望显著增加药物的内吞效率和肿瘤特异性，同时提高其疗效和安全性。通过降解egfr蛋白和高效递送细胞毒素，该药物为egfr阳性肿瘤的治疗提供了一种新的、更具潜力的治疗选择。

28、本发明提供的具有膜蛋白降解功能的抗体药物偶联物的构建方法，通过在抗体上化学偶联穿膜肽(cpp)和细胞毒素分子，构建了具有双重作用机制的adc药物。通过直接对抗体进行化学修饰，实现抗体与穿膜肽和细胞毒素分子的一体化构建，无需复杂的抗体表达与纯化过程，有助于降低生产成本，提高制备效率；通过促进抗原的內吞和溶酶体转运不仅实现了抗原靶标的降解，能够解除抗原自身促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的内在功能，同时也能提高adc药物的内吞效率，从而增加adc药物在肿瘤细胞内的浓度，实现细胞毒素在肿瘤细胞中的精准释放，提高细胞杀伤效果。本发明方法获得的adc药物内吞效率和细胞毒素释放量显著提高，具有更强的细胞毒性，从而更有效地杀伤肿瘤细胞，适用于更多类型的肿瘤细胞和抗原靶标，拓宽了adc药物的应用范围，本发明制备方法为adc药物的研发提供了新的思路和方向，具有广阔的应用前景和临床价值。

29、进一步地，通过使用三(2-羧乙基)膦打开单克隆抗体上的一对或两对二硫键来偶联细胞穿膜肽，得到抗体-细胞穿膜肽复合物，再使用三(2-羧乙基)膦打开抗体-细胞穿膜肽复合物上的两对或三对二硫键来偶联细胞毒素mc-ggfg-dxd或mc-vc-pab-mmae，构建同时包含细胞穿膜肽和细胞毒素的adc药物。

30、本发明提供的应用，本发明adc药物可用于传统adc药物难以治疗的靶点(内吞效率不足的靶点)，适用于更多类型的肿瘤细胞和抗原靶标，拓宽了adc药物的适用范围，在肿瘤疾病的治疗中具有非常好的应用前景。