艾曲泊帕在制备MdmX蛋白抑制剂及抗肿瘤药物中的用途

本发明属于生物医药，具体涉及已知上市药物艾曲泊帕（eltrombopag，商品名promacta®/revolade®）的第二种医药用途（药物再利用，drug repurposing），即艾曲泊帕作为mdmx（murine double minute x，亦称mdm4、hdmx）蛋白抑制剂及抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

1、mdmx（亦称mdm4）是p53抑癌通路中最为关键的负反馈调控因子之一。p53蛋白被誉为"基因组守护者"，在正常细胞中负责感知dna损伤、癌基因激活、缺氧胁迫等多种内外源应激信号，并通过协调性启动下游效应基因的转录程序来维持基因组稳定性，包括经由p21/waf1/cdkn1a通路诱导g1/s期细胞周期阻滞、经由puma/bbc3和bax启动线粒体凋亡程序，以及通过转录抑制slc7a11表达来削弱细胞抗氧化防御并促进铁死亡。在约50%保留野生型tp53基因的恶性肿瘤中，p53蛋白本身并未发生突变或缺失，但其肿瘤抑制功能被异常过表达的mdm2和mdmx功能性沉默。mdm2主要通过其c端ring结构域发挥e3泛素连接酶活性，催化p53蛋白的k48等赖氨酸多聚泛素化修饰并将其靶向至26s蛋白酶体降解；mdmx虽然因ring结构域关键催化残基的序列差异导致其固有的e3泛素连接酶活性远弱于mdm2，但可通过其n端p53结合结构域直接占据p53的转录激活表面（且亲和力高于mdm2），从而高效阻断p53的反式转录激活功能。此外，mdmx还可通过其c端ring结构域与mdm2形成功能性异源二聚体，进一步增强mdm2对p53的泛素化降解效率。mdm2和mdmx基因分别敲除的小鼠模型均呈现p53依赖性的早期胚胎致死表型，从经典遗传学层面充分证实了二者在p53信号调控网络中的不可相互替代性。

2、当前，以罗氏公司idasanutlin（rg7388）和诺华公司siremadlin（hdm201）为代表的mdm2单靶点小分子抑制剂已推进至临床试验阶段。然而，多项临床研究的亚组分析和药效学生物标志物监测数据揭示了mdmx的代偿性反馈上调制约mdm2抑制剂疗效持久性。mdm2被药理学抑制后，细胞内p53蛋白水平迅速积累，活化的p53四聚体入核并结合于mdmx基因启动子区域的p53反应元件（p53re），反式激活mdmx的基因转录，导致mdmx蛋白水平发生代偿性上调，持续抑制残留及新增p53蛋白的转录活性。因此，直接靶向mdmx不仅是克服mdm2抑制剂代偿性耐药的关键策略，也为mdmx过表达型恶性肿瘤提供了靶向治疗路径。然而，mdmx作为一个药物靶点具有显著的结构生物学挑战：其p53结合界面比mdm2的更浅、更平坦，入口处关键残基tyr99的芳香环侧链被邻近残基（leu104和phe93）刚性锁定为“封闭式”构象，缺乏mdm2同源残基tyr100在配体诱导下可向外翻转呈“开放式”构象的动态构象，导致以mdm2深部疏水裂缝为模板设计的nutlin类抑制剂（nutlin-3a、idasanutlin等）在mdmx上难以有效适配。目前，全球尚无mdmx靶向小分子抑制剂进入临床试验阶段。

3、艾曲泊帕是一种口服生物可利用的小分子血小板生成素（tpo）受体激动剂，化学名为3'-[(2z)-[1-(3,4-二甲基苯基)-1,5-二氢-3-甲基-5-氧代-4h-吡唑-4-亚基]肼基]-2'-羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸，分子式c25h22n4o4，分子量442.47 g/mol。该化合物于2008年获美国fda批准用于慢性免疫性血小板减少症（itp），疏水性染料监测蛋白热去折叠，随后适应症扩展至重型再生障碍性贫血（saa）和肝炎相关血小板减少症。其口服剂型（商品名promacta®/revolade®）已覆盖12.5 mg至75 mg的剂量规格，每日给药一次。其口服生物利用度约52%-70%，血浆蛋白结合率＞99%，半衰期约21-32小时。其已知唯一药理靶点为tpo-r/c-mpl跨膜结构域上的非经典别构位点。在已公开全部文献和专利中，艾曲泊帕从未被报道具有mdmx结合活性或抗肿瘤活性。

技术实现思路

1、为解决现有mdmx靶向小分子匮乏、mdm2抑制剂易因mdmx代偿上调产生耐药、p53野生型肿瘤缺乏可快速转化靶向药物的技术问题，本发明提供了艾曲泊帕在制备mdmx蛋白抑制剂及抗肿瘤药物中的用途。艾曲泊帕以分子楔子方式结合mdmx f19疏水亚口袋，kd达2.47μm，通过阻断mdmx-p53相互作用、上调p21/puma，降解mdmx及下调slc7a11三重机制发挥抗肿瘤活性，对hct116、mcf-7细胞ic50分别为1.94μm、3.69μm。该药物为已上市口服制剂，可依托现有临床安全性数据快速推进mdmx靶向抗肿瘤新适应症转化。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、本发明提供了艾曲泊帕（eltrombopag，cas号：496775-61-2）在制备mdmx蛋白抑制剂中的应用。

4、所述mdmx蛋白抑制剂用于制备抗肿瘤药物。

5、所述艾曲泊帕以分子楔子方式结合于mdmx蛋白的f19疏水亚口袋，与p53p△f19多肽协同增强三元复合物的热力学稳定性。

6、所述肿瘤为p53野生型肿瘤。

7、所述肿瘤选自结肠癌、乳腺癌和非小细胞肺癌中的至少一种。

8、所述药物与mdm2蛋白抑制剂联合使用。

9、艾曲泊帕在制备铁死亡诱导剂或铁死亡敏化剂中的应用。

10、本发明基于以下关键发现：艾曲泊帕是发明人通过大规模高通量虚拟筛选和逐级生化验证，从约12,000个商业可购分子中发现的p53p△f19-n-mdmx靶向抑制剂。艾曲泊帕以分子楔子方式精准嵌入mdmx蛋白因p53 phe19残基及相邻残基缺失而暴露的f19疏水亚口袋，与p53p△f19多肽分别占据p53结合结构域口袋的不同亚区，通过蛋白构象的整体稳定化产生协同增效。

11、艾曲泊帕通过独特的三重药理机制发挥抗肿瘤作用：（a）占据f19疏水亚口袋阻断mdmx-p53蛋白-蛋白相互作用，释放p53转录活性，恢复p53下游因子p21和puma蛋白的表达，同时启动细胞周期阻滞和线粒体凋亡程序；（b）通过经典的泛素-蛋白酶体负反馈途径实现对mdmx靶蛋白的深度清除，释放的p53蛋白进一步反式激活下游mdm2的基因转录，mdm2作为e3泛素连接酶特异性介导mdmx的k48多聚泛素化降解，在5-20μm区间实现mdmx近乎完全清除；（c）通过p53的转录抑制功能下调slc7a11表达，削弱肿瘤细胞铁死亡防御，在20μm时实现slc7a11近乎完全抑制。

12、全原子分子动力学（100 ns）模拟进一步揭示：艾曲泊帕对mdmx n端柔性区域（残基13-18）具有独特的n端锁定效应，将该区域的rmsf从其他候选复合物中的0.3-0.9 nm锐减至约0.1 nm，全蛋白cα原子平均rmsf仅0.0743 nm。

13、有益效果：

14、（1）首次发现了fda批准上市药物艾曲泊帕作为mdmx靶向抑制剂的全新药理活性。艾曲泊帕以分子楔子方式精准占据mdmx蛋白f19疏水亚口袋，kd=2.47×10-6 m，亲和力在已报道的非肽类mdmx小分子配体中处于领先水平，较阳性对照nutlin-3a（kd=2.23×10-4m）提升约90倍，且呈现典型的kd驱动型慢解离结合特征（kd=9.99×10-3 s-1），结合持久性优异。

15、（2）艾曲泊帕在多个p53野生型肿瘤细胞系中展现低微摩尔级强效增殖抑制活性（hct116结肠癌ic50=1.94μm、mcf-7乳腺癌ic50=3.69μm），并实现p53凋亡通路与铁死亡通路的双重协同激活。

16、（3）艾曲泊帕通过泛素-蛋白酶体途径实现mdmx靶蛋白的深度清除（5-20μm近完全清除），并对slc7a11呈剂量依赖性显著下调（20μm近乎完全抑制），填补了mdmx靶向分子在铁死亡机制方向的研究空白。

17、（4）分子动力学模拟揭示的n端锁定效应，将n端柔性区域rmsf降低至约0.1 nm，全蛋白rmsf仅0.0743 nm，从原子层面阐明了艾曲泊帕复合物结构稳定性最优的动力学基础。