用于综合评价免疫检查点抗体体外功能与效力的方法及其应用与流程

本发明属于生物医药与免疫肿瘤学，具体涉及一种用于系统评价免疫检查点抗体体外功能与效力的综合评价方法，尤其涉及通过整合信号通路阻断、t细胞活化、免疫调节、肿瘤微环境模拟及肿瘤细胞杀伤等多个功能维度，构建免疫检查点抗体体外效力的综合评价方法及其应用。

背景技术：

1、程序性死亡受体1（programmed death-1，pd-1）及其配体程序性死亡配体1（programmed death ligand-1，pd-l1）构成机体重要的免疫检查点通路，在维持免疫耐受和调控t细胞功能中发挥关键作用。pd-1主要表达于活化t细胞、b细胞表面，而pd-l1广泛表达于肿瘤细胞、抗原递呈细胞等多种细胞表面。当pd-l1与pd-1结合后，可激活t细胞内抑制性信号通路，降低t细胞增殖能力、细胞因子分泌及细胞毒性活性，从而抑制机体抗肿瘤免疫反应。肿瘤细胞可通过高表达pd-l1逃避免疫系统监视和清除。

2、近年来，基于本作用机制开发的pd-1/pd-l1免疫检查点抗体广泛应用于多种实体瘤治疗，因此，在生物类似药研发、候选药物分子筛选过程中，亟需系统性评价其体外功能与效力的方法。

3、目前，免疫检查点抗体体外活性的评价主要采用以下方法：

4、（1）pd-1/pd-l1信号通路阻断检测。通常利用表达pd-1和pd-l1的工程化细胞模型，通过检测荧光素酶报告基因或其他下游信号变化评价抗体对pd-1/pd-l1信号通路的阻断能力；

5、（2）混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction，mlr）：通过不同供体来源免疫细胞共培养，检测细胞因子释放、t细胞活化标志物表达或t细胞增殖情况，以评价抗体促进t细胞活化的能力；

6、（3）超抗原刺激体系：采用葡萄球菌肠毒素b（seb）等超抗原刺激外周血单个核细胞（pbmc）或全血，检测细胞因子释放或活化标志物变化，以评价t细胞免疫调节能力；

7、（4）pbmc介导肿瘤细胞杀伤体系：评价抗体增强免疫细胞抗肿瘤杀伤能力。

8、上述方法分别从不同免疫阶段评价抗体功能，但通常相互独立，缺乏统一的系统评价框架。具体而言：阻断实验仅反映靶点结合功能，无法体现免疫效应恢复；mlr与seb体系反映t细胞活化，但不能模拟真实肿瘤环境；杀伤实验虽贴近终点效应，但无法反映早期免疫调控过程。因此，现有技术难以实现对免疫检查点抗体从“靶点阻断—免疫激活—效应发挥”全过程的系统性评价，也缺乏统一的量化比较标准。

技术实现思路

1、解决上述问题，本发明提供一种用于评价免疫检查点抗体体外功能与效力的综合评价方法。本发明的技术方案如下：

2、第一方面， 本发明提供一种用于综合评价免疫检查点抗体体外功能与效力的方法，其中，所述综合评价方法是综合信号阻断评价模块、免疫激活评价模块、免疫检查点抗体免疫调节模块和终末免疫效应评价模块所得评价指标计算综合效力指数（comprehensive potency index，cpi），对候选免疫检查点抗体整体体外功能进行综合评价；其中，所述综合效力指数(cpi)按照下式计算：cpi=w1*bs+w2*as+w3*ims+w4*tes ；其中，w1、w2、w3及w4分别表示各功能模块对应的权重，满足w1+w2+w3+w4=1；所述权重根据免疫检查点抗体类型、研发目的或评价需求进行设定。其中，bs表示信号阻断评分，as表示免疫激活评分，ims表示免疫调节评分，tes表示终末免疫效应评分。

3、在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤： （1）建立信号阻断评价模块，检测免疫检查点抗体对免疫检查点信号通路的阻断能力，获得信号阻断评分（blocking score，bs）； （2）建立免疫激活评价模块，检测免疫检查点抗体促进t细胞活化及细胞因子释放的能力，获得免疫激活评分（activation score，as）； （3）建立免疫检查点抗体免疫调节模块，获得免疫调节评分（immune modulation score，ims）； （4）建立终末免疫效应评价模块，检测免疫检查点抗体增强免疫细胞介导肿瘤细胞杀伤的能力，获得终末免疫效应评分（terminal effector score，tes）； （5）根据步骤（1）至步骤（4）所得评价指标建立综合效力指数（comprehensive potency index，cpi），对候选免疫检查点抗体整体体外功能进行综合评价。 在一些实施方式中，所述信号阻断评价模块采用免疫检查点信号通路报告基因检测体系评价免疫检查点抗体阻断信号通路的能力，并根据ec50计算信号阻断评分。 在一些实施方式中，所述免疫激活评价模块采用混合淋巴细胞反应体系检测il-2、ifnγ中的一种或两种细胞因子的释放水平，并根据il-2、ifnγ评分计算免疫激活评分。 在一些实施方式中，所述免疫调节模块用于评价免疫检查点抗体对已经启动的免疫反应过程的调节能力，其中所述外源刺激体系优选为超抗原刺激体系。 在一些实施方式中，所述超抗原为葡萄球菌肠毒素b（seb）。 在一些实施方式中，免疫调节模块，测得的全血il-2和ifnγ释放水平，取各细胞因子最大响应值作为最大释放含量计算外源刺激评分。 在一些实施方式中，所述终末免疫效应评价模块采用pbmc与肿瘤细胞共培养体系检测肿瘤细胞杀伤率，并根据所述杀伤率计算终末免疫效应评分。 在一些实施方式中，所述肿瘤细胞为表达免疫检查点配体的肿瘤细胞。 在一些实施方式中，所述标准化处理采用参照抗体进行归一化计算。 在一些实施方式中，所述参照抗体为与待评价免疫检查点抗体具有相同作用靶点的已知免疫检查点抗体。 在一些实施方式中，所述免疫检查点抗体选自抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、抗lag-3抗体、抗tigit抗体、抗tim-3抗体中的一种，或者为针对上述免疫检查点任意两种或两种以上靶点的双特异性抗体或多特异性抗体。 在一些实施方式中，所述免疫检查点抗体为作用于pd-1/pd-l1信号通路的免疫检查点抗体。 在一些实施方式中，所述免疫检查点抗体选自抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、同时结合pd-1和pd-l1的双特异性抗体，以及包含pd-1或pd-l1结合结构域的多特异性抗体中的一种；所述参照抗体为抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体。 在一些实施方式中，所述抗pd-1抗体包括pembrolizumab、nivolumab、cemiplimab、sintilimab、camrelizumab、tislelizumab、toripalimab或serplulimab中的一种或其生物类似药；所述抗pd-l1抗体包括atezolizumab、durvalumab或avelumab中的一种或其生物类似药。 在一些实施方式中，其中，阻断功能评分（blocking score，bs）按照下式计算：) ;

4、免疫激活评分（activation score，as）按照下式计算： ；其中，

5、， ；

6、免疫调节评分（immune modulation score，ims）按照下式计算：

7、 ；

8、终末免疫效应评分（terminal effector score，tes）按照下式计算： ；

9、其中，bs越高，表明抗体阻断pd-1/pd-l1信号通路能力越强；或as越高，表明恢复t细胞功能能力越强；或ims值越高，表明免疫检查点抗体对已经启动的免疫反应过程的调节能力越强；或tes值越高，表明抗体恢复pbmc终末杀伤功能的能力越强。 在一些实施方式中，所述候选抗体首先根据基础作用机制评价指标进行资格准入，再进行综合评分。 在一些实施方式中，根据综合效力指数确定候选抗体开发优先级。 第二方面，本发明提供了第一方面所述的方法在免疫检查点药物开发中的应用，其中，所述综合评价方法可应用于以下场景：（1）候选免疫检查点抗体的早期筛选及优选；（2）候选抗体研发决策；（3）不同候选抗体整体功能比较；（4）抗体工程优化评价；（5）生物类似药一致性评价；（6）体外药效学质量控制及批间一致性评价；（7）免疫检查点抗体综合评价平台构建；（7）其他涉及免疫检查点抗体体外功能评价的需求。

10、该方法依据免疫检查点抗体发挥药理作用的连续生物学过程，建立由pd-1/pd-l1信号阻断能力、免疫功能恢复、免疫调节能力及pbmc介导肿瘤细胞杀伤能力构成的多维功能评价体系，并进一步建立标准化评分方法、综合效力指数（cpi），实现候选抗体体外功能的统一评价、横向比较及标准化筛选。

11、进一步地，本发明建立标准化研发决策规则，根据综合效力指数及各功能模块评价结果，对候选抗体进行综合判定，为候选抗体进入后续体内药效评价、结构优化或终止开发提供依据。

12、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

13、（1）本发明依据免疫检查点抗体发挥药理作用的连续生物学过程建立综合评价体系，实现了由基础作用机制、免疫功能恢复、免疫调节至终末抗肿瘤效应的连续评价，而非多个独立检测方法的简单组合，提高了候选抗体体外功能评价的完整性。

14、（2）本发明建立统一标准化评分方法，将不同实验终点转换为可横向比较的功能评价指标，并进一步建立综合效力指数（cpi），实现不同候选抗体整体体外功能的统一评价及横向比较，提高了评价结果的客观性、可重复性及一致性。

15、（3）本发明建立"资格准入—综合评分—研发决策"的标准化评价流程，将综合效力指数作为候选抗体筛选及研发决策的重要依据，为免疫检查点抗体候选分子的优选提供了一种标准化、可量化、可重复的综合评价方法，提高了候选抗体筛选效率及研发决策的科学性。