一种水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和肉毒梭菌的五联疫苗及其制备方法和应用

本发明涉及兽用生物制品领域，特别是涉及一种水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和肉毒梭菌的五联疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

1、水貂犬瘟热、水貂细小病毒性肠炎、水貂出血性肺炎、水貂肺炎克雷伯氏菌病及水貂肉毒梭菌毒素中毒症是严重危害水貂养殖业的五种主要疫病。其中，犬瘟热病毒以侵害黏膜系统为主要特征，常致双相体温升高及卡他性肺炎，死亡率可达80%；水貂细小病毒性肠炎以剧烈腹泻为特征，由水貂细小病毒引起，该病于1949年被首次发现，其后被证明病原为细小病毒；水貂出血性肺炎发病急、死亡快，常呈地方性暴发，由铜绿假单胞菌感染所致；肺炎克雷伯氏菌作为条件致病菌，在转群、炎热、换料、天气骤变等可导致动物机体抵抗力下降的应激条件下，该菌大量繁殖从而引发水貂急性脓肿、蜂窝织炎及败血症等，常与铜绿假单胞菌形成混合感染；肉毒梭菌毒素中毒则与水貂饲料中腐败的鱼类、禽类副产品密切相关，水貂被列为肉毒梭菌毒素的易感动物之一，中毒后死亡率接近100%。目前，疫苗免疫仍是预防上述疫病的主要手段，现有产品主要为单苗或二联灭活疫苗，如水貂病毒性肠炎灭活疫苗、水貂出血性肺炎二价灭活疫苗及肉毒梭菌中毒症灭活疫苗等。

2、然而，由于上述五种疫病各自需要分别或组合免疫，养殖户在实际生产中不得不对水貂进行多次、多针次的免疫接种。由于水貂本身性情敏感，在多次捕捉和注射过程中极易产生强烈的应激反应，表现为食欲不振、精神萎靡，严重时可导致免疫失败，甚至是死亡。同时，多次免疫显著增加了养殖户的劳动强度和免疫成本，降低了生产效率和动物福利水平。尽管现有技术中已有针对其中两种疫病的二联灭活疫苗，但仍无法同时覆盖犬瘟热病毒、水貂细小病毒、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌及肉毒梭菌五种主要病原，难以实现“一针多防”的免疫目标。开发一种能够同时预防上述五种疫病的多联疫苗，成为本领域亟待解决的技术问题。

3、在研发多联疫苗的过程中，面临的主要困难在于：不同病原体（病毒、革兰氏阴性菌、厌氧芽孢杆菌）的最佳培养条件、灭活工艺、抗原配比及佐剂相容性差异较大，简单混合各自单苗可能导致抗原相互干扰、免疫原性下降或局部不良反应增强。此外，现有疫苗产品在适用范围上存在明显局限，已公开的技术方案大多仅针对成年健康水貂进行效力评价，缺乏对不同月龄（尤其是幼龄及老龄）水貂免疫安全性的系统研究，亦未涉及妊娠水貂这一特殊群体的使用安全性评估。由于妊娠水貂生理状态特殊，对免疫刺激的耐受性较低，而幼龄水貂免疫系统尚未发育完全，二者均属于疫苗应用中风险较高的群体。现有技术中尚无针对同时涵盖犬瘟热病毒、细小病毒、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌及肉毒梭菌五种抗原的五联疫苗产品在不同月龄及妊娠水貂中安全性验证的报道，这为临床安全应用留下了技术空白。因此，开发一种配比科学、工艺稳定、免疫效果可靠，且对不同月龄及妊娠水貂均安全的五联疫苗，对于实现一次免疫同时预防五种疫病、减少水貂应激及降低养殖成本具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和肉毒梭菌的五联疫苗及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供的水貂五联疫苗实现“一针多防”，一次接种可同时预防五种疫病，显著减少免疫次数，降低水貂应激和养殖成本。该疫苗免疫后21天攻毒保护率达100%，保护期为5个月，且对不同月龄及妊娠水貂均安全，保存期达18个月，具有良好的商业化应用前景。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和肉毒梭菌的五联疫苗，所述五联疫苗包括灭活组分和弱毒组分；所述灭活组分为灭活的水貂细小病毒抗原、灭活的铜绿假单胞菌抗原、灭活的肺炎克雷伯氏菌抗原和灭活的肉毒梭菌毒素抗原；所述弱毒组分为犬瘟热病毒的弱毒株病毒液冻干抗原；

4、所述水貂细小病毒抗原为水貂细小病毒mev-wh12株抗原，所述水貂细小病毒mev-wh12株的保藏编号为cgmcc no.47099；

5、所述肺炎克雷伯氏菌抗原为肺炎克雷伯氏菌（

klebsiella pneumoniae）k2-sd14株抗原，所述肺炎克雷伯氏菌k2-sd14株的保藏编号为cgmcc no.38101；

6、所述铜绿假单胞菌抗原为铜绿假单胞菌（

pseudomonas aeruginosa）dl-15株抗原；

7、所述犬瘟热病毒的弱毒株为犬瘟热病毒（

canine distemper virus）cdv-or12株。

8、可选的，所述水貂细小病毒抗原的含量不低于105.73tcid50/ml；所述铜绿假单胞菌抗原的含量不低于2.0×109cfu/ml；所述肺炎克雷伯氏菌抗原的含量不低于2.0×109cfu/ml；所述肉毒梭菌毒素抗原的含量不低于21440 mld/ml；所述犬瘟热病毒的弱毒株病毒液含量不低于103.90tcid50/ml。

9、可选的，所述五联疫苗中还包含佐剂和防腐剂。

10、可选的，所述佐剂为氢氧化铝胶佐剂；所述防腐剂为硫柳汞。

11、本发明还提供一种所述的五联疫苗的制备方法，包括以下步骤：

12、（1）分别制备灭活的水貂细小病毒抗原、灭活的铜绿假单胞菌抗原、灭活的肺炎克雷伯氏菌抗原、灭活的肉毒梭菌毒素抗原以及犬瘟热病毒的弱毒株病毒液；

13、（2）将步骤（1）制备的灭活的水貂细小病毒抗原、灭活的铜绿假单胞菌抗原、灭活的肺炎克雷伯氏菌抗原和灭活的肉毒梭菌毒素抗原分别稀释至目标浓度并混合；所述目标浓度为：水貂细小病毒抗原液不低于106.40tcid50/ml，铜绿假单胞菌抗原液不低于9.4×109cfu /ml，肺炎克雷伯氏菌抗原液不低于9.4×109cfu /ml，肉毒梭菌毒素抗原液毒力不低于1.0×105mld /ml；

14、（3）将稀释后的水貂细小病毒抗原液、铜绿假单胞菌抗原液、肺炎克雷伯氏菌抗原液和肉毒梭菌毒素抗原液按体积比1:1:1:1混合，得到混合抗原液，加入佐剂与防腐剂，作为灭活组分。

15、（4）将所述犬瘟热病毒的弱毒株病毒液稀释后，经冷冻干燥，复溶后使犬瘟热病毒的病毒含量不低于103.90tcid50/ml，单独作为弱毒组分；

16、（5）以所述灭活组分复溶所述弱毒组分，获得所述五联疫苗。

17、可选的，步骤（3）中，所述混合抗原液与所述佐剂的体积比为6:1。

18、可选的，步骤（3）中，所述防腐剂的加入量为所述混合抗原液与所述佐剂总体积的0.005%。

19、本发明还提供一种所述的五联疫苗或所述的制备方法制备的五联疫苗在制备预防水貂犬瘟热病、水貂细小病毒性肠炎、水貂出血性肺炎、水貂肺炎克雷伯氏菌病和水貂肉毒梭菌毒素中毒症的产品中的应用。

20、本发明公开了以下技术效果：

21、本发明提供的水貂五联疫苗，针对水貂养殖中五种主要疫病实现了“一针多防”。与现有单苗或二联疫苗需多次免疫相比，本发明一次接种即可同时预防水貂犬瘟热、细小病毒性肠炎、出血性肺炎、肺炎克雷伯氏菌病及肉毒梭菌毒素中毒症，显著减少了捕捉和注射次数，降低了水貂的应激反应，同时减轻了养殖户的劳动强度和免疫成本。经实验验证，该疫苗免疫后21天攻毒保护率即达100%，保护期可持续5个月，有效解决了现有技术中多针次免疫带来的实际问题。

22、此外，本发明通过系统的安全性验证，证实该疫苗对不同月龄（2～4月龄和8～10月龄）水貂以及妊娠水貂均具有良好的安全性，接种后仅有一过性体温升高，无局部或全身不良反应。同时，本发明明确了各抗原组分的最佳配比及含量，确保了疫苗的免疫效果和批间稳定性。该疫苗保存期为18个月，具有良好的商业化应用前景，为水貂养殖业提供了一种安全、高效、便捷的联合免疫解决方案。