一种基于钴的免疫检查点抑制剂及其在肿瘤免疫治疗中的应用

本发明属于纳米生物医学领域，特别涉及一种基于钴的免疫检查点抑制剂及其在肿瘤免疫治疗中的应用。

背景技术：

1、肿瘤微环境是由肿瘤细胞、基质细胞及胞外基质构成的动态体系，其代谢适应是驱动肿瘤增殖、侵袭与转移的核心。与此同时，免疫治疗虽显著改善了肿瘤预后，但患者应答差异极大，疗效也受到肿瘤微环境中免疫抑制状态的严格制约。由于肿瘤微环境存在高度代谢异质性与营养竞争，容易形成代谢性免疫抑制，不仅会直接降低免疫检查点抑制剂的治疗效果，还会引发耐药，进而成为制约免疫治疗的关键因素。

2、在众多免疫检查点分子中，ido1尤为重要，ido1是一种含血红素的单体酶，它可通过分解色氨酸、激活下游免疫抑制通路，诱导调节性t细胞和髓源性抑制细胞等免疫抑制细胞活化，进而构建免疫抑制微环境，且在多种肿瘤中高表达并与不良预后密切相关。目前已有多种ido1抑制剂进入临床研究，然而单药疗效普遍有限，多项临床试验接连受挫，具体机制仍有待阐明，因此靶向ido1的联合治疗及下游通路阻断成为未来的重要研究方向。

3、此外，ifnγ是调控肿瘤细胞高表达ido1的关键细胞因子，兼具抗肿瘤与促免疫耐受的双重作用：一方面可以增强抗原呈递、招募免疫细胞、直接杀伤肿瘤；另一方面又会上调pd-l1、ido1等抑制分子，介导免疫逃逸与治疗耐药，其信号通路异常也是影响免疫治疗应答的重要原因。

4、在此基础上，新兴的金属免疫学聚焦于金属离子与免疫系统的相互作用，多种金属离子可广泛调控先天免疫与适应性免疫。它们既能通过激活tlr、nlrp3及cgas-sting通路调控固有免疫应答，又能通过ca2+、mg2+、k+等离子信号调控t细胞活化、分化与功能，从而为肿瘤免疫干预提供了全新的靶点与策略。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供二价钴离子（co2）和/或钴基材料的应用。

2、本发明的另一目的在于提供一种钴基纳米材料conaha的制备方法。

3、本发明的再一目的在于提供上述方法制备得到的钴基纳米材料conaha。

4、本发明的目的通过下述技术方案实现：

5、二价钴离子（co2）和/或钴基材料的应用，所述的应用包括如下至少一个方面：

6、（a）制备抗肿瘤药物中的应用；

7、（b）制备免疫检查点抑制剂中的应用；

8、（c）制备肿瘤免疫调节剂中的应用；

9、（d）制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用。

10、（a）中，所述的抗肿瘤药物包括肿瘤免疫治疗药物、肿瘤免疫激活药物、金属免疫治疗药物等中的至少一种。

11、（a）、（c）和（d）中，所述的肿瘤为高表达ido1蛋白（相对于健康组织，肿瘤部位ido1蛋白显著高表达）和/或pd-l1蛋白的肿瘤，如结肠癌、胰腺癌、黑色素瘤等中的至少一种；优选为胰腺癌。

12、（b）中，所述的免疫检查点包括ido1和pd-l1中的至少一种；优选为ido1。

13、所述的二价钴离子（co2）和/或钴基材料能够抑制ifnγ诱导的多种肿瘤细胞的ido1表达，进而缓解ido1介导的免疫抑制，促进树突状细胞成熟、cd4+t细胞向调节性t细胞分化减少，促进cd8+t细胞增殖，cd8+t细胞耗竭水平减少、激活水平升高，同时能够抑制肿瘤细胞的增殖和迁移、促进肿瘤细胞的凋亡（抑制肿瘤生长），进而达到治疗癌症的目的。

14、所述的二价钴离子（co2）为钴化合物（钴盐，如氯化钴，cocl2）溶于溶剂获得的二价钴离子。

15、所述的钴基材料为钴基纳米材料；优选为钴基纳米材料conaha。

16、一种钴基纳米材料conaha的制备方法，包括如下步骤：

17、（1）将高碘酸盐加入到透明质酸水溶液中，于室温条件下避光反应，再加入乙二醇淬灭反应，经纯化和干燥，得到aha（式1）；

18、（2）将2-硝基咪唑、碳酸钾和（6-溴己基）氨基甲酸叔丁酯溶于n,n-二甲基甲酰胺中，于80±5℃条件下搅拌反应，待反应结束后冷却至室温，经抽滤、旋蒸浓缩、萃取、干燥和纯化，得到ni-nh2（式2）；

19、（3）将aha、ni-nh2、碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺溶于2-吗啉乙磺酸水溶液（2-吗啉乙磺酸缓冲液）中，于室温条件下搅拌反应，控制反应ph值为5.5±0.1，待反应结束后，纯化，干燥，得到naha（式3）；

20、（4）将naha与氯化钴（ii）溶于水中，于室温条件下避光反应，待反应结束后，经纯化和干燥，得到钴基纳米材料conaha。

21、步骤（1）中所述的高碘酸盐优选为高碘酸钠。

22、步骤（1）中所述的高碘酸钠、透明质酸与乙二醇的摩尔比为1：（0.8～1.2）：1；优选为1：1：1。

23、步骤（1）和（4）中所述的透明质酸水溶液中水优选为双蒸水或去离子水。

24、步骤（1）中所述的透明质酸水溶液的浓度为8～12 mg/ml；优选为10 mg/ml。

25、步骤（1）中所述的避光反应的时间为2～4小时；优选为2小时。

26、步骤（1）和（3）中所述的纯化为采用截留分子量为2000 da的透析袋进行纯化，所用的透析液为双蒸水或去离子水；优选为采用截留分子量为2000 da的透析袋纯化3天以上。

27、步骤（1）（3）和（4）中所述的干燥为冷冻干燥，具体为：先在液氮下预冷冻后，再在-50±5℃、真空度低于0.1 mbar的条件下冷冻干燥48～96 h（优选为72 h）。

28、步骤（2）中所述的2-硝基咪唑、碳酸钾和（6-溴己基）氨基甲酸叔丁酯的摩尔比为1：（1～2）：2；优选为1：1.05：2。

29、步骤（2）中所述的n,n-二甲基甲酰胺的用量为按每克2-硝基咪唑配比40～50 mln,n-二甲基甲酰胺计算。

30、步骤（2）中所述的搅拌反应的时间为10～15小时；优选为12小时。

31、步骤（2）中所述的萃取为采用乙酸乙酯对产物进行萃取，收集油相。

32、步骤（2）中所述的萃取的次数为3次以上，直至萃取后的乙酸乙酯基本不再改变颜色。

33、步骤（2）中所述的干燥为采用无水硫酸钠对油相进行干燥。

34、步骤（2）中所述的纯化通过如下步骤实现：加入二氯甲烷和三氟乙酸按体积比1:2混合得到的溶液，室温搅拌4小时，最后通过旋转蒸发仪蒸发去除有机溶剂。

35、步骤（3）中所述的aha、ni-nh2、碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为摩尔比为1：3：（1～2）：2；优选为1：3：1.5：2。

36、步骤（3）中所述的2-吗啉乙磺酸水溶液优选为ph 5.5、浓度0.1 m的2-吗啉乙磺酸水溶液。

37、步骤（3）中所述的搅拌反应的时间为12～24小时；优选为24小时。

38、步骤（4）中所述的naha与氯化钴的摩尔比为1：（3～5）；优选为1：5。

39、步骤（4）中所述的水的用量为按每克naha配比80～85 ml水计算。

40、步骤（4）中所述的搅拌反应的时间为24～48小时；优选为24小时。

41、步骤（4）中所述的纯化为采用截留分子量为500 da的透析袋进行纯化，所用的透析液为双蒸水或去离子水；优选为采用截留分子量为2000 da的透析袋纯化1天以上。

42、一种钴基纳米材料conaha，通过上述任一项所述的方法制备得到。

43、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

44、1、本发明以金属离子co2+为研究对象，发现co2具有增敏抗肿瘤免疫治疗能力，即钴离子通过抑制ifnγ介导的jak-stat1信号通路从而下调其下游的ido1和pd-l1表达，进而缓解肿瘤免疫抑制微环境，在促进树突状细胞成熟及cd8+t细胞激活的同时，兼具肿瘤杀伤的双重治疗效应，这种“一石二鸟”的作用机制不仅为多癌种（尤其是胰腺癌）治疗提供了全新解决方案，更弥补了现阶段金属免疫治疗中钴部分的研究不足，具有重要的临床转化价值。

45、2、本发明还提供了一种用于缓解肿瘤免疫抑制微环境的钴基纳米材料conaha的制备和应用，通过纳米递送体系conaha拓宽其体内应用，其中该conaha是以醛基化的透明质酸aha、氨基修饰的2-硝基咪唑和cocl2为原料制备得到。conaha能够通过抑制ifnγ介导的jak-stat1通路，从而抑制其下游免疫检查点ido1和pd-l1的表达，缓解cd8+t细胞耗竭，重塑肿瘤免疫微环境，可用于胰腺癌、结直肠癌和黑色素瘤等治疗方面。