一种寡核苷酸组合物及其制备方法和其应用与流程

本发明属于生物医药领域，涉及一种寡核苷酸组合物及其制备方法和其应用。

背景技术：

1、乙型肝炎（hepatitis b）由乙型肝炎病毒（hbv）感染引起的病毒性肝炎，主要经血液、性接触和母婴等途径传播（nicolini la, et al. int. j. environ. res. publichealth 2019, 16, 3307）。

2、慢性乙型肝炎（chb）的病理基础在于肝细胞内持续存在的共价闭合环状dna（cccdna），其作为病毒复制的稳定模板难以被清除。此外，hbv dna可随机整合入宿主基因组，虽不直接支持病毒复制，却能持续表达乙肝表面抗原（hbsag）和hbx蛋白等病毒抗原（suarez aar, et al. liver international. 2021;41，suppl. 1:15-23）。这些病毒蛋白的持续存在是导致免疫耐受和疾病进展的关键因素。

3、目前，临床主要治疗药物包括核苷（酸）类似物（nucs，如恩替卡韦、替诺福韦）和聚乙二醇干扰素α（peg-ifn-α）。但现有疗法难以彻底清除cccdna，导致hbsag阴转率极低，患者需长期甚至终身服药，以抑制病毒复制，停药后复发风险高。因此，实现chb的“功能性治愈”（即停药后hbsag持续消失、hbv dna检测不到、肝功能恢复正常及肝组织学改善），已成为当前治疗的终极目标。其中，hbsag消失被视为病毒复制被深度抑制和安全停药的核心指征。开发能够直接靶向病毒储存库或关键致病环节的创新药物，成为解决临床需求的迫切方向。

4、1998年，美国科学家andrew fire和craig mello首次揭示了rna干扰（rnai）现象，即双链rna（dsrna）可特异性介导同源mrna的降解（fire a, et al. nature 1998;391:806-811），并因此获得2006年诺贝尔生理学或医学奖。rnai的核心机制在于：外源或内源性dsrna被细胞内的dicer酶切割成小干扰rna（sirna）；随后，sirna与rna诱导沉默复合体（risc）结合，引导链引导risc特异性识别并切割互补的靶mrna，从而在转录后水平高效、特异地沉默基因表达。

5、rnai技术因其高度的特异性和有效性，已成为基因功能研究和药物开发的重要工具。合成的sirna可靶向人类、动物或植物中的特定致病基因，通过导入细胞激活内源性rnai通路，实现对目标蛋白表达的精准抑制。目前，针对病毒感染、心血管疾病、癌症等适应症的sirna药物已进入临床研发阶段，部分已获批上市。自2018年首款sirna药物问世以来，全球已有至少4款sirna疗法在欧美获批，标志着该技术已成功转化为有效的治疗手段。

6、尽管rnai技术前景广阔，但sirna的临床应用面临诸多挑战。sirna分子本身不稳定，易被核酸酶降解；且作为带负电荷的大分子，难以有效穿透细胞膜到达作用靶点。此外，药物的稳定性、给药途径、体内分布及浓度等因素，直接决定了其在制造、储存、运输及体内递送过程中的理化性质和生物学活性，进而影响治疗的有效性和安全性。因此，开发具有良好稳定性、递送效率和低毒副作用的sirna及其制剂成为干预慢性乙肝等疾病的迫切需求。

7、cn202411373939.2（公开时间为2025年5月2日）中公开了抑制乙肝病毒的小干扰rna，但申请中并没有涉及相关小干扰rna的制剂及稳定性研究，本发明为该专利技术的深入开发，其中的一些技术方案也适用本发明，将其引入到本发明中。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种寡核苷酸组合物，所述组合物含有寡核苷酸和药学上可接受的载体。

2、本发明的优选技术方案中，所述寡核苷酸包含正义链和反义链，其中，所述正义链为seq id no：1所示的序列或片段，所述反义链为seq id no：2所示的序列或片段。

3、本发明的优选技术方案中，所述seq id no：2被选自腺苷-2’磷酸(a-2’-5’)、鸟苷-二醇核酸(ggn)、腺苷-二醇核酸(agn)、n-(2,3-二羟基丙基)-3,5-二(三氟甲基)苯甲酰胺(gnf-bx)、5’-磷酸酯模拟物中的任一种或其组合所修饰或替代。

4、本发明的优选技术方案中，所述5’-磷酸酯模拟物在反义链的5’-末端发生修饰，优选5’-磷酸酯模拟物选自5’-氧基甲基膦酸酯、5’-乙烯基膦酸(vp)、5’乙烯基膦酸酯-2’-n-乙酰、5’-丙二酰基膦酸酯的任一种或其组合。

5、本发明的优选技术方案中，所述反义链5’端的第1至第8位的任一核酸被修饰或替代。

6、本发明的优选技术方案中，反义链5’-末端的第2至第8位任一核酸被a-2’-5’、ggn、agn、gnf-bx的任一种或其组合所替代。

7、本发明的优选技术方案中，反义链的5’端第5或第7位的任一位置为a-2’-5’、ggn、agn、gnf-bx的任一种或其组合所替代。

8、本发明的优选技术方案中，vp修饰在seq id no：2所示反义链序列的5’-末端，且ggn替代发生在反义链的5’端第5位核酸。

9、本发明的优选技术方案中，vp修饰在seq id no：2所示反义链序列的5’-末端，且a-2’-5’替代发生在反义链的5’端第7位核酸。

10、本发明的优选技术方案中，所述反义链的核苷酸序列选自seq id no：2- seq idno：11的任一所示序列或片段。

11、本发明的优选技术方案中，所述乙烯基膦酸酯修饰后的尿苷类似物结构为其中，u为尿嘧啶碱基。

12、本发明的优选技术方案中，所述反义链5’末端核苷酸经vp修饰后的化合物具有下述所示结构：

13、，

14、其中，x选自-sh，base尿嘧啶碱基，y为寡核苷酸上的其它核苷，a 为och3。

15、本发明的优选技术方案中，所述寡核苷酸的正义链为seq id no：1所示的序列或片段，所述反义链选自seq id no：2所示的序列或片段、seq id no：3所示的所示的序列或片段、seq id no：4所示的序列或片段、seq id no：5所示的序列或片段、seq id no：6所示的序列或片段、seq id no：7所示的序列或片段、seq id no：8所示的序列或片段、seq idno：9所示的序列或片段、seq id no：10所示的序列或片段、seq id no：11所示的序列或片段的任一种。

16、本发明的优选技术方案中，所述组合物为液体制剂。

17、本发明的优选技术方案中，以质量体积百分比计，组合物中含有0.3%~30%的寡核苷酸，优选0.4%~2%或10%~25%。

18、本发明的优选技术方案中，所述药学上可接受的载体任选地选自缓冲剂、渗透压调节剂的任一种或其组合。

19、本发明的优选技术方案中，所述组合物ph5.0~8.5，优选ph5.5-8.0，更优选为ph6.0-ph7.5。

20、本发明的优选技术方案中，组合物含有的缓冲剂为5-50mm，优选为10-20mm或40~50mm。。

21、本发明的优选技术方案中，所述缓冲剂选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠、碳酸盐、组氨酸-组氨酸盐酸盐、醋酸-醋酸钠、枸橼酸钠的任一种或其组合。

22、本发明的优选技术方案中，以质量体积百分比计，组合物中含有10%~25%的寡核苷酸、10mm-20mm的缓冲剂和注射用水，所述组合物ph6.0-7.0，其中，所述缓冲剂为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠。

23、本发明的优选技术方案中，以质量体积百分比计，组合物含有0.4%-2%的寡核苷酸、40mm-50mm的缓冲剂和注射用水，组合物ph6.0-7.0，其中，所述缓冲剂为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠。

24、本发明的优选技术方案中，所述组合物中任选地含有等渗调节剂。

25、本发明的优选技术方案中，所述渗透压调节剂选自葡萄糖、氯化钠的任一种。

26、本发明的优选技术方案中，所述组合物选自静脉施用或皮下施用的任一种。

27、本发明的另一目的在于提供一种寡核苷酸组合物的制备方法，将所需量的寡核苷酸与药学上可接受的载体均匀混合，即得。

28、本发明的优选技术方案中，所述组合物为液体制剂。

29、本发明的优选技术方案中，组合物中含有5-300mg/ml的寡核苷酸，优选为5-15mg/ml或100-200mg/ml。

30、本发明的优选技术方案中，所述药学上可接受的载体任选地选自缓冲剂、渗透压调节剂的任一种或其组合。

31、本发明的优选技术方案中，所述组合物ph5.0~8.5，优选ph5.5-8.0，更优选为ph6.0-ph7.5。

32、本发明的优选技术方案中，所述缓冲剂选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠、碳酸盐、组氨酸-组氨酸盐酸盐、醋酸-醋酸钠、枸橼酸钠的任一种或其组合。

33、本发明的优选技术方案中，组合物含有的缓冲剂为5-50mm。

34、本发明的优选技术方案中，在所需量的缓冲溶液加入所需量的寡核苷酸，均匀混合，即得。

35、本发明的另一目的在于提供一种药物组合包装，所述组合包装包括本发明的寡核苷酸和其他抗hbv药物组成。

36、本发明的优选技术方案中，所述的其他抗hbv药物选自核苷类似物类、乙肝病毒进入类抑制剂、衣壳组装抑制剂、hbsag分泌抑制剂、乙肝治疗性疫苗、宿主免疫调节剂、凋亡蛋白拮抗剂的任一种或其组合。

37、本发明的优选技术方案中，本发明的寡核苷酸和其他抗hbv药物选自先后用药或同时用药的任一种。

38、本发明的另一目的在于提供寡核苷酸组合物用于制备降低受试者血清中hbsag、hbeag、hbv dna的任一种或其组合的药物中的用途。

39、本发明的另一目的在于提供寡核苷酸组合物用于制备抗hbv感染、抗乙型病毒性肝炎、抗乙型肝炎病毒合并丁型肝病毒感染的任一种或其并发症的药物中的用途。

40、本发明的优选技术方案中，所述hbv感染是慢性hbv感染。

41、本发明所述的方法通常涉及向受试者施用有效量(即能够产生期望的治疗结果的量)的寡核苷酸。受试者的适当剂量与受试者的体型、体表面积、年龄、待施用的特定组合物、组合物中的一种或多种活性成分、施用的时间和途径、总体健康和同时施用的其他药物等相关因素相关。

42、除非另有说明，本发明的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。

43、本发明所述的“乙型肝炎病毒相关疾病”或“hbv相关疾病”是由hbv感染或复制引起或与其相关的疾病或病症。术语“hbv相关疾病”包括受益于hbv基因表达或复制减少的疾病、病症或病状。hbv相关疾病的非限制性实例包括例如急性乙型肝炎；急性暴发型乙型肝炎；慢性乙型肝炎；肝纤维化；末期肝病；和肝细胞癌。

44、本发明所述的“互补”是指核苷酸(例如，在相对的核酸上或在单一核酸链的相对区域上的两个核苷酸上)之间允许核苷酸彼此形成碱基对的结构关系。例如，一个核酸的与相对核酸的嘧啶核苷酸互补的嘌呤核苷酸可以通过彼此形成氢键而碱基配对在一起。

45、本发明的优选技术方案中，互补的核苷酸可以以沃森-克里克(watson-crick)方式或以允许形成稳定双链体的任何其他方式碱基配对。

46、本发明的优选技术方案中，两个核酸可以具有与彼此互补以便形成互补区域的核苷酸序列。

47、本发明中的核苷酸类似物可以作为核苷酸单体替代主链上的核苷酸，所述核苷酸类似物包括但不限于：2’-甲氧基乙基修饰(moe)的核苷酸、2'-甲氧基(m)修饰的核苷酸、2'-脱氧-2'-氟(f)修饰的核苷酸、硫代磷酸酯(s)基修饰的核苷酸、腺苷-2’磷酸(a-2’-5’)、尿苷-2’磷酸(u-2’-5’)、鸟苷-2’磷酸(g-2’-5’)、鸟苷-二醇核酸(ggn)、腺苷-二醇核酸(agn)、n-(2,3-二羟基丙基)-3,5-二(三氟甲基)苯甲酰胺(gnf-bx)修饰的核苷酸或5’-磷酸酯模拟物修饰的核苷酸。

48、除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

49、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果。

50、1、本发明的寡核苷酸对hbv转基因小鼠hbsag、hbv dna和hbeag具有显著的抑制效果，毒性小；组方组成简单，更利于制品的安全，且可保持长期稳定，即使在浓度高达约200mg/ml，室温条件下是也是可稳定存在的，可稳定24个月或更长时间；活性。

51、2、本发明所提供的制备方法具有操作简便、条件温和、绿色环保，无需复杂设备，生产成本较低，适合于大规模工业化生产等优点。