BCKDHB基因座来源环状RNA及其表达载体在治疗高血糖或2型糖尿病方面的应用

本发明涉及一种环状rna用于制备核酸药物的应用，尤其涉及bckdhb基因座来源环状rna及其表达载体在治疗高血糖或2型糖尿病方面的应用，属于核酸药物及代谢性疾病治疗。

背景技术：

1、糖尿病是一组以慢性高血糖为主要特征的代谢性疾病，其中2型糖尿病占绝大多数，其发生发展与胰岛素抵抗、胰岛β细胞代偿性胰岛素分泌增加以及随后出现的β细胞功能失代偿密切相关。持续的高葡萄糖、高脂质及炎症刺激可进一步加重β细胞应激、凋亡和胰岛素分泌障碍，并引起肝脏、骨骼肌和脂肪组织等多器官代谢异常。

2、现有2型糖尿病治疗手段包括生活方式干预、胰岛素增敏剂、促胰岛素分泌药物、glp-1受体激动剂、sglt2抑制剂及胰岛素治疗等，但部分患者仍会出现血糖控制不足、胰岛β细胞功能持续下降或长期依从性不足等问题。因此，研制能够直接改善胰岛β细胞功能、缓解高血糖状态并具有新作用机制的核酸药物或基因治疗策略，具有重要应用价值。

3、环状rna是由前体mrna经反向剪接形成的一类共价闭合rna分子，不具有游离的5′端和3′端从而对外切核酸酶具有较强耐受性。部分环状rna呈现组织、细胞类型或发育阶段特异性表达，可通过结合微rna或rna结合蛋白、调节亲本基因转录或翻译等方式参与细胞功能调控。上述特性使环状rna及其表达调控体系具有作为核酸药物靶点或治疗性核酸分子的潜在价值[1-3]。

4、已有研究表明，胰岛细胞中存在大量环状rna，并表现出细胞类型选择性表达，且部分胰岛表达的环状rna与2型糖尿病状态相关[4-6]。例如，circhipk3、cdr1as以及来源于胰岛素基因内含子的环状rna能够影响β细胞存活、增殖或胰岛素分泌[4,7]。这些研究提示，特定胰岛环状rna并非单纯转录副产物，而可能参与β细胞适应、代偿和功能维持。然而，不同环状rna的来源、反向剪接位点、组织分布及功能方向具有明显特异性，不能由其他环状rna的已知作用直接推知。

5、对于治疗用途而言，环状rna相关技术仍面临靶细胞递送、组织偏向性表达、环化效率及体内功能验证等问题。已有研究表明，将胰岛素基因来源的β细胞偏好性启动子与aav载体结合，可用于实现胰岛β细胞偏向性的外源核酸表达[8]。因此，在胰岛β细胞中表达目标环状rna时，可进一步结合促进环化的侧翼序列，以提高目标环状rna的形成和表达。

6、bckdhb基因编码支链α-酮酸脱氢酶复合体e1β亚基，该复合体催化支链氨基酸分解代谢的关键限速反应。支链氨基酸及其代谢中间产物异常与肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病相关[9]。因此，由bckdhb基因座产生的非编码转录本可能与胰岛代谢适应及糖代谢稳态有关，但亲本基因的已知代谢功能并不能替代对其环状转录本结构、表达和功能的直接验证。

7、现有数据库虽已收录hsa_circ_0077164和mmu_circ_0001822，但数据库收录通常仅提供序列或反向剪接位点信息，并未揭示提高该环状rna表达是否能够改善高血糖或2型糖尿病相关糖代谢异常。现有技术尚未见关于circbckdhb上述疾病相关表达特征、胰岛富集特征及其通过β细胞偏好性表达载体改善糖代谢作用的系统报道。

8、以上背景技术内容涉及的参考文献如下：

9、[1] chen ll, yang l. regulation of circrna biogenesis. rna biology,2015, 12(4):381-388.

10、[2] kristensen ls, andersen ms, stagsted lvw, et al. the biogenesis,biology and characterization of circular rnas. nature reviews genetics, 2019,20(11):675-691.

11、[3] tehrani ss, goodarzi g, panahi g, et al. multiple novel functionsof circular rnas in diabetes mellitus. archives of physiology andbiochemistry, 2023, 129(6):1235-1249.

12、[4] stoll l, sobel j, rodriguez-trejo a, et al. circular rnas asnovel regulators of beta-cell functions in normal and disease conditions.molecular metabolism, 2018, 9:69-83.

13、[5] kaur s, mirza ah, pociot f. cell type-selective expression ofcircular rnas in human pancreatic islets. non-coding rna, 2018, 4(4):38.

14、[6] haque s, ames rm, moore k, et al. islet-expressed circular rnasare associated with type 2 diabetes status in human primary islets and inperipheral blood. bmc medical genomics, 2020, 13:64.

15、[7] stoll l, rodriguez-trejo a, guay c, et al. a circular rnagenerated from an intron of the insulin gene controls insulin secretion.nature communications, 2020, 11:5611.

16、[8] mulder nl, havinga r, kluiver j, groen ak, kruit jk. aav8-mediated gene transfer of microrna-132 improves beta cell function in micefed a high-fat diet. journal of endocrinology, 2019, 240(2):123-132.

17、[9] lynch cj, adams sh. branched-chain amino acids in metabolicsignalling and insulin resistance. nature reviews endocrinology, 2014, 10(12):723-736.

技术实现思路

1、本发明的主要目的是：针对现有技术存在的问题，提供一种bckdhb基因座来源环状rna、其表达载体在治疗高血糖或2型糖尿病方面的应用，用于制备治疗2型糖尿病和/或高血糖的核酸药物，能够提高胰岛中bckdhb基因座来源环状rna表达、并改善高血糖及葡萄糖耐量异常。

2、本发明解决其技术问题的技术方案如下：

3、一种环状rna用于制备治疗2型糖尿病和/或高血糖的药物的应用，环状rna为seqid no.1所示的circbckdhb或seq id no.2所示的circbckdhb。

4、本发明还提出：一种表达构建体，具有表达盒，所述表达盒包括胰岛β细胞偏好性启动子、用以转录环状rna的核酸序列以及位于核酸序列两侧且促进环化的侧翼序列；所述环状rna为seq id no.1所示的circbckdhb或seq id no.2所示的circbckdhb。

5、优选地，所述胰岛β细胞偏好性启动子为seq id no.8所示的rip2启动子；所述侧翼序列为seq id no.9所示的5′ circ-frame序列和seq id no.10所示的3′ circ-frame序列，其中，5′ circ-frame序列位于核酸序列的5′端，3′ circ-frame序列位于核酸序列的3′端。

6、更优选地，所述表达盒的序列为seq id no.11或seq id no.13。

7、该表达构建体能够在细胞中表达bckdhb基因座来源环状rna。

8、本发明还提出：一种含有上述表达构建体的表达载体。

9、优选地，所述表达载体为质粒载体或重组腺相关病毒载体。

10、更优选地，所述重组腺相关病毒载体为采用aav8衣壳、并由大鼠ins2基因rip2启动子驱动小鼠circbckdhb或人源circbckdhb表达的aav8-rip2-circbckdhb或aav8-rip2-circbckdhb。

11、更优选地，所述重组腺相关病毒载体采用的病毒载体骨架为seq id no.14所示paav-mcs载体骨架，并且将该病毒载体骨架第150-1394位的cmv/β-globin intron/mcs区替换为seq id no.11或seq id no.13所示表达盒。

12、本发明还提出：一种含有上述表达构建体和/或上述表达载体的药物组合物。

13、优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂中的至少一个。

14、本发明还提出：上述表达构建体、上述表达载体、或上述药物组合物用于制备治疗2型糖尿病和/或高血糖的药物的应用。

15、优选地，所述药物的功能包括提高胰岛组织中circbckdhb和/或circbckdhb表达，降低空腹血糖和/或改善葡萄糖耐量。

16、优选地，所述药物的具体功能至少包括治疗由肥胖或高脂饮食诱导的高血糖、葡萄糖耐量受损、2型糖尿病样糖代谢异常之一。

17、与现有技术相比，本发明的环状rna具有明确的环化结构和rnase r耐受性，且在胰岛中相对富集；人源circbckdhb在2型糖尿病患者血清及2型糖尿病供体人胰岛中表达降低，为选择治疗靶点提供疾病相关性依据；采用胰岛β细胞偏好性aav8-rip2-circbckdhb能够使小鼠胰岛circbckdhb表达显著升高，而心、肝、脂肪、骨骼肌及肾中的表达与对照组相比无统计学显著差异；提高小鼠胰岛circbckdhb表达能够降低模型动物空腹血糖并改善葡萄糖耐量。因此，本发明提供了一种提高胰岛中bckdhb基因座来源环状rna表达并改善高血糖及葡萄糖耐量异常的核酸干预方案。