用于基因组整合的方法和组合物与流程

背景技术：

1、细胞疗法是一个快速发展的领域，用于应对治疗疾病时遇到的困难，诸如癌症、持续性感染和某些对其他治疗形式难治的疾病。细胞疗法常利用经离体工程改造后施用于生物体的细胞，以纠正体内缺陷。有效且可靠的细胞基因组操作系统至关重要，因为当工程化细胞被施用于生物体时，它能以最佳状态发挥作用并具有延长的有效性。同样，可靠的基因操作机制形成了基因疗法成功的基石。然而，在以治疗上安全且有效的方式递送核酸货物（例如大货物）的方法中仍存在严重缺陷。病毒递送机制常用于在细胞中递送大核酸货物，但伴随着安全问题，并且无法在某些细胞类型中用于表达该货物。另外，使细胞经受重复的基因操作可能影响细胞健康，诱导细胞周期改变，并使细胞不适合用于治疗用途。为了治疗目的，在该领域不断寻求有效递送和稳定外源引入的遗传物质的进展。

技术实现思路

1、本文提供了一种组合物，其包含：(a) rna分子，其包含：(i)插入序列的反向互补序列，其中该反向互补序列包含(a)为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列，其可操作地连接至(b)为启动子序列的反向互补序列的序列，其中为启动子序列的反向互补序列的序列位于为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列的下游；(ii) 5’同源臂和3’同源臂；和(iii)编码人orf2p多肽的序列，其中该编码人orf2p多肽的序列位于5’同源臂的上游或3’同源臂的下游；(b)核酸内切酶或编码该核酸内切酶的多核酸序列；以及(c)一种或多种向导rna分子或编码该一种或多种向导rna分子的一种或多种多核酸，其中该一种或多种向导rna分子包含第一向导rna分子和第二向导rna分子，其中该第一向导rna分子包含能够与靶细胞的基因组dna的第一靶序列杂交的序列，并且该第二向导rna分子包含能够与靶细胞的基因组dna的第二靶序列杂交的序列。

2、本文还提供了一种组合物，其包含：(a) rna分子，其包含：(i)插入序列的反向互补序列，其中该反向互补序列包含(a)为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列，其可操作地连接至(b)为启动子序列的反向互补序列的序列，其中为启动子序列的反向互补序列的序列位于为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列的下游；(ii) 5’同源臂和3’同源臂；和(iii)编码具有逆转录酶活性的多肽的序列，其中该编码具有逆转录酶活性的多肽的序列位于5’同源臂的上游或3’同源臂的下游；(b)核酸内切酶或编码该核酸内切酶的多核酸序列；以及(c)一种或多种向导rna分子或编码该一种或多种向导rna分子的一种或多种多核酸，其中该一种或多种向导rna分子包含第一向导rna分子和第二向导rna分子，其中该第一向导rna分子包含能够与靶细胞的基因组dna的第一靶序列杂交的序列，并且该第二向导rna分子包含能够与靶细胞的基因组dna的第二靶序列杂交的序列。

3、本文还提供了一种组合物，其包含：(a) rna分子，其包含：(i)插入序列的反向互补序列，其中该反向互补序列包含(a)为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列，其可操作地连接至(b)为启动子序列的反向互补序列的序列，其中为启动子序列的反向互补序列的序列位于为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列的下游；(ii)位于为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列上游的5’同源臂和位于为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列下游的3’同源臂；和(iii)编码具有逆转录酶活性的多肽的序列，其中该编码具有逆转录酶活性的多肽的序列位于5’同源臂的上游或3’同源臂的下游；(b)核酸内切酶或编码该核酸内切酶的多核酸序列；以及(c)一种或多种向导rna分子或编码该一种或多种向导rna分子的一种或多种多核酸，其中该一种或多种向导rna分子包含第一向导rna分子和第二向导rna分子，其中该第一向导rna分子包含能够与靶细胞的基因组dna的第一靶序列杂交的序列，并且该第二向导rna分子包含能够与靶细胞的基因组dna的第二靶序列杂交的序列。

4、在一些实施方案中，(a)的rna分子包含(b)的编码核酸内切酶的多核酸序列。

5、在一些实施方案中，5’同源臂或3’同源臂的序列的长度为约50个核苷酸。

6、在一些实施方案中，编码核酸内切酶的多核酸序列位于5’同源臂序列的上游或3’同源臂序列的下游。

7、在一些实施方案中，编码核酸内切酶的多核酸序列存在于与(a)的rna分子不同的多核酸分子中。

8、在一些实施方案中，(a)的rna分子包含(c)的编码一种或多种向导rna分子的一种或多种多核酸，并且其中编码一种或多种向导rna分子的一种或多种多核酸位于5’同源臂序列的上游或3’同源臂序列的下游。

9、在一些实施方案中，第一向导rna分子包含能够与靶细胞的基因组dna的第二链的第一靶序列杂交的序列，并且第二向导rna分子包含能够与靶细胞的基因组dna的第一链的第二靶序列杂交的序列。

10、在一些实施方案中，靶细胞的基因组dna的第二链的第一靶序列与靶细胞的基因组dna的第一链的第二靶序列之间的核碱基数为约10-1000个核碱基、约50-500个核碱基或约100-300个核碱基。

11、在一些实施方案中，5’同源臂序列包含能够与靶细胞的基因组dna的第二链的靶序列杂交的序列，并且3’同源臂序列包含能够与靶细胞的基因组dna的第一链的靶序列杂交的序列。

12、在一些实施方案中，3’同源臂的序列包含用由cas 9切口产生的第一链上的3’瓣片引发的序列。

13、在一些实施方案中，5’同源臂所杂交的基因组dna的第二链的靶序列的3’端与3’同源臂所杂交的第一链的靶序列的3’端相距最多50、40、30、20、10、5、4、3、2或1个碱基。

14、在一些实施方案中，能够与基因组dna第一链的靶序列杂交的3’同源臂序列的序列与能够与第二向导rna序列杂交的靶细胞基因组dna第一链的第二靶序列重叠。

15、在一些实施方案中，能够与基因组dna第一链的靶序列杂交的3’同源臂序列的序列位于能够与第二向导rna序列杂交的靶细胞基因组dna第一链的第二靶序列下游（3’）最多50、40、30、20、10、5、4、3、2或1个碱基处。

16、在一些实施方案中，编码多肽的外源序列的侧翼为5’同源臂和3’同源臂。

17、在一些实施方案中，核酸内切酶是切口酶。

18、在一些实施方案中，切口酶是cas9切口酶。

19、在一些实施方案中，cas9切口酶相对于野生型cas9包含h840a突变。

20、在一些实施方案中，cas9切口酶由与seq id no: 124具有至少90%序列同一性的核酸序列编码。

21、在一些实施方案中，编码核酸内切酶的多核酸序列是rna序列。

22、在一些实施方案中，一种或多种向导rna分子包含含有第一向导rna序列的第一向导rna分子和含有第二向导rna序列的第二向导rna分子，并且其中第一向导rna分子与第一核酸内切酶分子形成复合物，并且第二向导rna分子与第二核酸内切酶分子形成复合物。

23、在一些实施方案中，一种或多种向导rna分子指导核酸内切酶切割(i)靶细胞的基因组dna的第一链和(ii)靶细胞的基因组dna的第二链。

24、在一些实施方案中，一种或多种向导rna分子不会指导核酸内切酶在靶细胞的基因组dna中产生双链断裂（dsb）。

25、在一些实施方案中，第一向导rna分子指导核酸内切酶切割靶细胞的基因组dna的第一链，并且第二向导rna分子指导核酸内切酶切割靶细胞的基因组dna的第二链。

26、在一些实施方案中，基因组dna的第一链的第一切割与基因组dna的第二链的第二切割之间的核碱基数为约10-1000个碱基、约50-500个碱基或约100-300个碱基。

27、在一些实施方案中，靶细胞的基因组dna的第一靶序列和靶细胞的基因组dna的第二靶序列位于靶细胞的基因组dna的同一区域内。

28、在一些实施方案中，靶细胞的基因组dna的第一靶序列和靶细胞的基因组dna的第二靶序列位于靶细胞的基因组dna的同一基因座内。

29、在一些实施方案中，基因座是基因组安全港基因座。

30、在一些实施方案中，基因座是非核糖体dna。

31、在一些实施方案中，靶细胞的基因组dna的第一靶序列和靶细胞的基因组dna的第二靶序列不包含核糖体dna的序列。

32、在一些实施方案中，基因座是小鼠rosa26基因座、腺相关病毒位点1（aavs1）、ccr5基因、hek3、prnp或ids基因座的人直系同源物。

33、在一些实施方案中，靶细胞基因组dna的第一靶序列和靶细胞基因组dna的第二靶序列包含来自靶细胞基因组dna内的单基因的序列。

34、在一些实施方案中，该单基因是非必需基因。

35、在一些实施方案中，具有逆转录酶活性的多肽促进(i)插入序列的反向互补序列的逆转录，从而产生插入序列，(ii)将插入序列整合至靶细胞的基因组dna中，或(iii)经由靶标引发逆转录（tprt）将插入序列整合至靶细胞的基因组dna中。

36、在一些实施方案中，具有逆转录酶活性的多肽促进(i)插入序列在靶细胞基因组dna的第一靶序列处整合至靶细胞基因组dna中，(ii)插入序列在靶细胞基因组dna的第二靶序列处整合至靶细胞基因组dna中，或(iii)两者。

37、在一些实施方案中，编码具有逆转录酶活性的多肽的序列包含可移动遗传元件序列。

38、在一些实施方案中，编码具有逆转录酶活性的多肽的序列包含人可移动遗传元件序列。

39、在一些实施方案中，可移动人可移动遗传元件包含line-1或其片段。

40、在一些实施方案中，具有逆转录酶活性的多肽包含人orf2p多肽或其功能片段。

41、在一些实施方案中，人orf2p多肽或其功能片段缺乏核酸内切酶（en）活性。

42、在一些实施方案中，人orf2p多肽或其功能片段在核酸内切酶结构域中包含导致缺乏核酸内切酶活性的突变。

43、在一些实施方案中，人orf2p多肽或其功能片段相对于野生型人orf2p包含在d205处的突变。

44、在一些实施方案中，d205处的突变包含相对于野生型人orf2p的d205a突变。

45、在一些实施方案中，人orf2p多肽或其功能片段是人orf2p多肽的缺少核酸内切酶结构域的功能片段。

46、在一些实施方案中，组合物还包含(d) rna分子，其包含编码缺少功能性核酸内切酶结构域的人orf2p多肽的序列，其中(d)的rna分子缺少编码人orf1p多肽的序列或编码多肽的外源序列。

47、在一些实施方案中，缺少功能性核酸内切酶结构域的人orf2p多肽包含外源dna结合结构域。

48、在一些实施方案中，外源dna结合结构域提高人orf2p多肽或其功能片段的dna结合活性。

49、在一些实施方案中，外源dna结合结构域提高人orf2p多肽或其功能片段的tprt持续合成能力。

50、在一些实施方案中，外源dna结合结构域包含sso7d dna结合结构域。

51、在一些实施方案中，sso7d dna结合结构域包含与seq id no: 152具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。

52、在一些实施方案中，(d)的rna分子包含与seq id no: 144具有至少90%序列同一性的序列。

53、在一些实施方案中，外源dna结合结构域来源于hmgd蛋白。

54、在一些实施方案中，外源dna结合结构域包含与seq id no: 154具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。

55、在一些实施方案中，(d)的rna分子包含与seq id no: 164具有至少90%序列同一性的序列。

56、在一些实施方案中，外源dna结合结构域增加核酸内切酶向靶细胞基因组dna中的靶序列的直接募集。

57、在一些实施方案中，外源dna结合结构域来源于hparp1蛋白。

58、在一些实施方案中，外源dna结合结构域包含hparp1蛋白的znf1结构域和znf2结构域。

59、在一些实施方案中，外源dna结合结构域包含与seq id no: 155具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。

60、在一些实施方案中，(d)的rna分子包含与seq id no: 146具有至少90%序列同一性的序列。

61、在一些实施方案中，另外的dna结合结构域经由接头可操作地连接至人orf2p多肽的功能片段。

62、在一些实施方案中，接头是柔性接头。

63、在一些实施方案中，柔性接头包含33xten接头。

64、在一些实施方案中，缺少功能性核酸内切酶结构域的人orf2p多肽是缺少核酸内切酶结构域的人orf2p多肽。

65、在一些实施方案中，(a)的rna分子的量与(d)的rna分子的量的比率为约5:1。

66、在一些实施方案中，(a)的rna分子还包含编码人orf1p多肽的序列，其中该编码人orf1p多肽的序列位于5’同源臂的上游或3’同源臂的下游。

67、在一些实施方案中，编码人orf1p多肽的序列和编码人orf2p多肽的序列由orf间序列分隔。

68、在一些实施方案中，编码人orf1p多肽的序列和编码人orf2p多肽的序列由(a)编码gss接头的序列和(b)编码t2a切割序列的序列分隔。

69、在一些实施方案中，编码人orf1多肽的序列包含与seq id no: 10具有至少90%序列同一性的序列。

70、在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。

71、在一些实施方案中，多肽选自由配体、抗体、受体、酶、转运蛋白、结构蛋白、激素、收缩蛋白、储存蛋白和转录因子组成的组。

72、在一些实施方案中，多肽是选自由嵌合抗原受体（car）和t细胞受体（tcr）组成的组的受体。

73、在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞、人细胞、原代细胞、离体细胞或体内细胞。

74、在一些实施方案中，靶细胞是选自由t细胞、b细胞、髓系细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞组成的组的免疫细胞。

75、在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种递送媒介物，其用于将rna分子、核酸内切酶或编码核酸内切酶的多核酸序列和一种或多种向导rna分子或编码一种或多种向导rna分子的一种或多种多核酸递送至靶细胞中。

76、在一些实施方案中，一种或多种递送媒介物选自由以下组成的组：纳米颗粒递送媒介物、质粒载体和病毒载体。

77、在一些实施方案中，病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。

78、在一些实施方案中，纳米颗粒递送媒介物选自由脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒组成的组。

79、在一些实施方案中，3’同源臂包含seq id no: 49、51、53、55、57、59、61或63中任一者的核酸序列。

80、在一些实施方案中，5’同源臂包含seq id no: 48、50、52、54、56、58、60或62中任一者的核酸序列。

81、在一些实施方案中，(a)的rna分子包含编码具有d205a突变的人orf2p的核酸序列，并且其中该核酸序列包含与seq id no: 129具有至少90%序列同一性的序列。

82、本文还提供了一种药物组合物，其包含(a)前述实施方案中任一项的组合物；和(b)药学上可接受的赋形剂。

83、本文还提供了一种基因编辑系统，其用于将编码外源治疗性多肽的外源序列掺入靶细胞的基因组中，该系统包含组合物，该组合物包含：(a)核酸内切酶或编码其的多核酸；(b)第一向导rna序列或编码其的多核酸；(c)第二向导rna序列或编码其的多核酸；以及(d)包含编码逆转录转座子机制的序列的rna，该rna包含：(i)为编码外源治疗性多肽的序列的反向互补序列的序列；和(ii)位于编码外源治疗性多肽的序列侧翼的5’同源臂和3’同源臂，并且其中每个同源臂与基因组中的靶位点的序列互补；和(iii)编码人line1 orf1p或其功能片段的序列；和(iv)编码包含逆转录酶（rt）的人orf2p的序列，其中orf2p的核酸内切酶活性失活。

84、在一些实施方案中，核酸内切酶是切口酶，并且其中切口酶是(i) cas9切口酶，或(ii)相对于野生型cas9包含h840a突变的cas 9切口酶。

85、在一些实施方案中，侧翼为两个同源臂的核酸序列不包含编码核酸内切酶、line1orf1p或orf2p或其片段的序列或与这些序列重叠。

86、在一些实施方案中，该系统还包含(e) rna分子，其包含编码缺少功能性核酸内切酶结构域的人orf2p多肽的序列，其中(d)的rna分子缺少编码人orf1p多肽的序列或编码多肽的外源序列，其中该缺少功能性核酸内切酶结构域的人orf2p多肽包含外源dna结合结构域，其中该外源dna结合结构域提高(i)人orf2p多肽或其功能片段的dna结合活性，(ii)人orf2p多肽或其功能片段的tprt持续合成能力，或(iii)核酸内切酶向靶细胞基因组dna中的靶序列的直接募集。

87、本文还提供了一种在靶哺乳动物细胞的基因组中的特定位点处掺入编码治疗性多肽的外源序列的方法，该方法包括使靶哺乳动物细胞与前述实施方案中任一项的组合物接触，其中仅将编码治疗性多肽的外源序列整合至靶哺乳动物细胞的基因组中。

88、本文还提供了一种在靶哺乳动物细胞的基因组中的特定位点处掺入编码治疗性多肽的外源序列的方法，该方法包括：(a)使靶哺乳动物细胞与组合物接触，该组合物包含：(i)核酸内切酶或编码其的多核酸；(ii)第一向导rna序列或编码其的多核酸；(iii)第二向导rna序列或编码其的多核酸序列；和(iv) rna分子，其包含：(a) rna序列，其为编码治疗性多肽的外源序列的反向互补序列；(b) 5’同源臂和3’同源臂；和(c)人可移动遗传元件，其包含编码促进编码治疗性多肽的外源序列经由靶标引发逆转录（tprt）整合至靶哺乳动物细胞的基因组中的多肽的序列；以及(b)从靶哺乳动物细胞的基因组掺入序列表达编码治疗性多肽的外源序列；

89、其中，仅编码治疗性多肽的外源序列是在靶哺乳动物细胞的基因组中的特定位点处掺入的基因组掺入序列。

90、在一些实施方案中，切口酶是cas9切口酶。

91、在一些实施方案中，rna序列的侧翼为5’同源臂和3’同源臂，该rna序列为编码治疗性多肽的外源序列的反向互补序列。

92、在一些实施方案中，侧翼为两个同源臂的核酸序列不包含编码核酸内切酶或人可移动遗传元件或其片段的序列或与这些序列重叠。

93、在一些实施方案中，人可移动遗传元件包含人line1的一种或多种元件。

94、在一些实施方案中，人line1的一种或多种元件包含orf1p或其功能片段。

95、在一些实施方案中，编码人orf1p多肽的序列和编码人orf2p多肽的序列由(a)编码gss接头的序列和(b)编码t2a切割序列的序列分隔。

96、在一些实施方案中，人line 1的一种或多种元件包含orf2p逆转录酶。

97、在一些实施方案中，人line 1的一种或多种元件包含orf2p核酸内切酶结构域（en），并且其中orf2p的核酸内切酶活性失活。

98、在一些实施方案中，通过引入选自由s228p、y1180a和d205a组成的组的一个或多个突变使orf2p的核酸内切酶活性失活。

99、在一些实施方案中，通过截短使orf2p的核酸内切酶活性失活。

100、在一些实施方案中，步骤(a)中的组合物还包含(v) rna分子，其包含编码缺少功能性核酸内切酶结构域的人orf2p多肽的序列，其中(d)的rna分子缺少编码人orf1p多肽的序列或编码多肽的外源序列。

101、在一些实施方案中，缺少功能性核酸内切酶结构域的人orf2p多肽缺少核酸内切酶结构域。

102、在一些实施方案中，人orf2p多肽包含外源dna结合结构域。

103、在一些实施方案中，外源dna结合结构域来源于(i) sso7d蛋白，(ii) hmgd蛋白，或(iii) parp1蛋白。

104、在一些实施方案中，外源dna结合结构域经由接头可操作地连接至orf2p。

105、在一些实施方案中，接头是33xten接头。

106、在一些实施方案中，(iv)的rna分子的量与(v)的rna分子的量的比率为约5:1。

107、在一些实施方案中，cas9切口酶在距离靶哺乳动物细胞的基因组中的特定位点1000、800、600、400、200或100个核苷酸内的位点处切割基因组dna。

108、在一些实施方案中，该方法防止基因组dna上的双链断裂。

109、在一些实施方案中，第一向导rna序列包含与基因组dna的第一链上的多个连续核苷酸具有沃森-克里克配对的序列，并且第二向导rna序列包含与基因组dna的第二且相对链上的多个连续核苷酸具有沃森-克里克配对的序列。

110、在一些实施方案中，第一向导rna序列和第二向导rna序列不包含与基因组dna的多个连续核苷酸具有沃森-克里克配对的序列，该多个连续核苷酸自身彼此互补。

111、在一些实施方案中，使靶哺乳动物细胞与组合物接触包括将组合物递送至靶哺乳动物细胞中。

112、在一些实施方案中，使用选自由脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒组成的组的纳米颗粒将组合物递送至靶哺乳动物细胞。

113、在一些实施方案中，治疗性多肽选自由配体、抗体、受体、酶、转运蛋白、结构蛋白、激素、收缩蛋白、储存蛋白和转录因子组成的组。

114、在一些实施方案中，治疗性多肽是选自由嵌合抗原受体（car）和t细胞受体（tcr）组成的组的受体。

115、在一些实施方案中，靶哺乳动物细胞是选自由t细胞、b细胞、髓系细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞组成的组的免疫细胞。

116、在一些实施方案中，包含编码促进编码治疗性多肽的外源序列经由靶标引发逆转录（tprt）整合至靶哺乳动物细胞的基因组中的多肽的序列的人可移动遗传元件包含(i)编码orf1p的序列和(ii)编码orf2p的序列，其中(i)和(ii)两者位于同一多核酸分子上。

117、在一些实施方案中，orf2p核酸内切酶包含具有d205a突变的序列。

118、在一些实施方案中，核酸内切酶是cas9切口酶，其由与编码人可移动遗传元件的多核苷酸分子分开的多核苷酸分子编码。

119、在一些实施方案中，第一向导rna序列和第二向导rna序列由与编码人可移动遗传元件的多核苷酸分子分开的多核苷酸分子编码。

120、在一些实施方案中，使靶哺乳动物细胞与(i)第一组合物接触，该第一组合物包含rna分子，该rna分子包含为编码治疗性多肽的外源序列的反向互补序列的mrna序列、5’同源臂和3’同源臂以及人可移动遗传元件，该接触是在与使靶哺乳动物细胞与(ii)第二组合物接触分开的时间进行，该第二组合物包含第一向导rna序列和第二向导rna序列或编码它们的一种或多种多核酸序列。

121、在一些实施方案中，接触包括使靶哺乳动物细胞与第一组合物和第二组合物以至少2小时的间隔进行接触。

122、在一些实施方案中，靶哺乳动物细胞在与第一组合物接触后3、4、5、6、7或8小时与第二组合物接触。

123、在一些实施方案中，核酸内切酶是cas9切口酶，其中在靶哺乳动物细胞与第一组合物接触的同时，使cas 9切口酶与靶哺乳动物细胞接触。

124、在一些实施方案中，使靶哺乳动物细胞与包含cas9切口酶或编码其的多核酸的组合物接触，该接触(i)在与包含rna分子的第一组合物接触之前进行，该rna分子包含为编码治疗性多肽的外源序列的反向互补序列的mrna序列、5’同源臂和3’同源臂以及人可移动遗传元件；或(ii)在与包含第一向导rna序列和第二向导rna序列或编码它们的一种或多种多核酸序列的第二组合物接触之前进行；或(iii)在与第二组合物接触之后进行。

125、在一些实施方案中，使靶哺乳动物细胞与编码cas9切口酶的rna接触。

126、在一些实施方案中，5’同源臂和3’同源臂相对于编码治疗性多肽的外源序列的反向互补序列的取向被逆转，以用于将外源序列以相反取向插入。

127、在一些实施方案中，5’同源臂或3’同源臂的序列的长度为10-80个核苷酸之间、20-70个核苷酸之间、30-60个核苷酸之间、40-60个核苷酸之间、15-20个核苷酸之间、少于20个核苷酸、约18个核苷酸或约17个核苷酸。

128、在一些实施方案中，5’同源臂或3’同源臂的序列的长度为约30个核苷酸。

129、在一些实施方案中，5’同源臂或3’同源臂的序列的长度为约50个核苷酸。

130、本文还提供了一种单mrna分子，其包含用于将编码治疗性多肽的外源序列掺入靶细胞的基因组中的基因组编辑系统，该基因组编辑系统包含：(a) cas核酸内切酶或其功能片段；(b)人line1逆转录转座子逆转录酶或其片段，和(c)编码治疗性多肽的外源序列，其侧翼为包含非核糖体基因组序列的一个或多个同源臂；或(d)包含(c)的反向互补序列的序列。

131、在一些实施方案中，cas核酸内切酶是cas 9核酸内切酶，并且cas核酸内切酶是cas 9切口酶。

132、在一些实施方案中，编码治疗性多肽的外源序列的长度大于1kb、1.2kb、1.5kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.5kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、4kb或5kb。

133、本文还提供了一种组合物，其包含前述实施方案中任一项的单mrna分子和核酸递送媒介物，并且其中该核酸递送媒介物包含一种或多种脂质。

134、在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种向导rna。

135、在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种sirna。

136、在一些实施方案中，组合物还包含一个或多个核定位序列（nls），并且其中该nls有助于将一种或多种orf多肽转运至细胞核中。

137、在一些实施方案中，nls是sv40 nls。

138、本文还提供了一种用于治疗受试者的疾病的药物组合物，其包含：(a)包含编码cas9切口酶的序列的rna；(b) rna，其包含为编码治疗性多肽的外源序列的反向互补序列的序列；5’同源臂和3’同源臂，其中5’同源臂或3’同源臂相对于基因组dna的一条链上的序列呈反向互补取向；和编码人可移动遗传元件的序列；(c)包含第一向导rna序列和第二向导rna序列或编码它们的一种或多种多核酸序列的组合物；以及治疗上可接受的赋形剂，其中(a)、(b)和(c)的组合物中的每一者被包含在分开的递送媒介物中。

139、本文还提供了一种组合物，其包含：(a) rna分子，其包含：(i)插入序列的反向互补序列，其中该反向互补序列包含(a)为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列，其可操作地连接至(b)为启动子序列的反向互补序列的序列，其中为启动子序列的反向互补序列的序列位于为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列的下游；(ii) 5’同源臂和3’同源臂；和(iii)编码经修饰的人line1序列或其片段的序列，其中该编码经修饰的人line1序列或其片段的序列位于5’同源臂的上游或3’同源臂的下游；(b)编码核酸内切酶的rna分子，其中该核酸内切酶是切口酶；(c)包含编码包含核酸内切酶的人orf2p多肽的序列的rna分子，其中该核酸内切酶是功能缺陷的；以及(d)一种或多种向导rna分子或编码该一种或多种向导rna分子的一种或多种多核酸，其中该一种或多种向导rna分子包含第一向导rna分子和第二向导rna分子，其中该第一向导rna分子包含能够与靶细胞的基因组dna的第一靶序列杂交的序列，并且该第二向导rna分子包含能够与靶细胞的基因组dna的第二靶序列杂交的序列。

140、在一些实施方案中，编码经修饰的人line1序列或其片段的序列包含编码人orf2p多肽的序列，其中该人orf2p多肽包含核酸内切酶和逆转录酶，其中该核酸内切酶包含突变。

141、在一些实施方案中，编码经修饰的人line1序列或其片段的序列包含位于编码人orf2p多肽的序列上游的编码人orf1p多肽的序列并且由line1 orf间序列分隔。

142、在一些实施方案中，编码经修饰的人line1序列或其片段的序列包含位于编码人orf2p多肽的序列上游的编码人orf1p多肽的序列并且由ires序列或切割位点分隔。

143、在一些实施方案中，编码经修饰的人line1序列或其片段的序列包含位于编码人orf2p多肽的序列上游的编码人orf1p多肽的序列并且由(a)编码gss接头的序列和(b) t2a切割序列分隔。

144、在一些实施方案中，编码经修饰的人line1序列的序列以及编码人orf2p多肽的序列包含orf2p核酸内切酶结构域中的突变，其中orf2p核酸内切酶结构域中的突变使核酸内切酶功能缺陷。

145、在一些实施方案中，orf2p核酸内切酶均无核酸内切酶活性。

146、在一些实施方案中，人orf2p多肽缺少核酸内切酶结构域，并且其中人orf2p多肽包含外源dna结合结构域。

147、在一些实施方案中，外源dna结合结构域来源于(i) sso7d蛋白，(ii) hmgd蛋白，或(iii) parp1蛋白。

148、在一些实施方案中，包含编码人orf2p多肽的序列的rna分子包含5’甲基化鸟苷帽结构（m7g帽）。

149、在一些实施方案中，包含编码人orf2p多肽的序列的rna分子经由经典的帽依赖性机制进行翻译。

150、在一些实施方案中，rna分子(c)中编码人orf2p多肽的序列位于rna分子(c)的5’端。

151、在一些实施方案中，在经修饰的人line1序列中，编码人orf2p多肽的序列包含n末端nls和c末端nls。

152、在一些实施方案中，切口酶是功能性切口酶，并且其中切口酶包含n末端nls、c末端nls、或n末端和c末端nls两者。

153、在一些实施方案中，编码经修饰的人line1序列或其片段的序列在编码人orf2p多肽的序列、编码人orf1p多肽的序列或两者的末端处包含一个或多个终止密码子。

154、在一些实施方案中，rna分子中的任一者包含一个或多个核糖体进入位点、一个或多个切割位点或一个或多个寡聚化结构域。

155、在一些实施方案中，rna分子中的每一者在3’端包含poly a序列。

156、在一些实施方案中，(c)的rna分子还包含插入序列的反向互补序列，其中该反向互补序列包含(a)为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列，其可操作地连接至(b)为启动子序列的反向互补序列的序列，其中为启动子序列的反向互补序列的序列位于为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列的下游。

157、在一些实施方案中，(c)的rna分子还包含5’同源臂和3’同源臂。

158、在一些实施方案中，(c)的rna分子不包含编码orf1p的序列。

159、在一些实施方案中，(c)的rna分子不包含插入序列的反向互补序列。

160、在一些实施方案中，(c)的rna分子由编码人orf2p多肽的序列与至少一个nls组成。

161、在一些实施方案中，启动子包含ef1α启动子或功能变体。

162、在一些实施方案中，ef1α启动子是全长ef1α启动子。

163、在一些实施方案中，ef1α启动子是短ef1α启动子。

164、本文还提供了一种组合物，其包含：(a) rna分子，其包含：(i)插入序列的反向互补序列，其中该反向互补序列包含(a)为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列，其可操作地连接至(b)为启动子序列的反向互补序列的序列，其中为启动子序列的反向互补序列的序列位于为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列的下游；(ii) 5’同源臂和3’同源臂；和(iii)编码包含核酸内切酶的人ofr2p多肽的序列，其中该核酸内切酶是功能缺陷的；(b)编码核酸内切酶的rna分子，其中该核酸内切酶是切口酶；(c)包含编码人orf1p的序列的rna分子，其中该rna分子不包含编码人orf2p的序列；(d)一种或多种向导rna分子或编码该一种或多种向导rna分子的一种或多种多核酸，其中该一种或多种向导rna分子包含第一向导rna分子和第二向导rna分子，其中该第一向导rna分子包含能够与靶细胞的基因组dna的第一靶序列杂交的序列，并且该第二向导rna分子包含能够与靶细胞的基因组dna的第二靶序列杂交的序列。

165、在一些实施方案中，(c)的rna分子由编码人orf1p的序列组成。

166、本文还提供了一种用于在靶哺乳动物细胞的基因组中的特定位点处掺入编码治疗性多肽的外源序列的方法，该方法包括使哺乳动物靶细胞与前述实施方案中任一项的组合物接触，其中仅将编码治疗性多肽的外源序列整合至靶哺乳动物细胞的基因组中。

167、在一些实施方案中，与其中为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列未可操作地连接至为启动子序列的反向互补序列的序列或不包含启动子的系统相比，整合效率提高了至少0.1%、0.2%或0.5%。

168、本文还提供了一种组合物，其包含：(a) rna分子，其包含：(i)插入序列的反向互补序列，其中该反向互补序列包含(a)为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列，其可操作地连接至(b)为启动子序列的反向互补序列的序列，其中为启动子序列的反向互补序列的序列位于为编码多肽的外源序列的反向互补序列的序列的下游；(ii) 5’同源臂和3’同源臂；和(iii)编码人orf1p多肽和人ofr2p多肽的序列，该人orf2p多肽包含核酸内切酶，其中该核酸内切酶是功能缺陷的；(b)编码核酸内切酶的rna分子，其中该核酸内切酶是切口酶；(c)包含编码人orf2p的序列的rna分子，其中该rna分子不包含编码人orf1p的序列或插入序列的反向互补序列；(d)一种或多种向导rna分子或编码该一种或多种向导rna分子的一种或多种多核酸，其中该一种或多种向导rna分子包含第一向导rna分子和第二向导rna分子，其中该第一向导rna分子包含能够与靶细胞的基因组dna的第一靶序列杂交的序列，并且该第二向导rna分子包含能够与靶细胞的基因组dna的第二靶序列杂交的序列，其中与缺少(c)的组合物相比，插入序列的整合效率提高了至少0.05%。

169、本文还提供了一种治疗受试者的疾病的方法，其包括向受试者施用(a)前述实施方案中任一项的组合物或(b)前述实施方案中任一项的药物组合物。

170、在一些实施方案中，疾病是癌症。

171、以引用方式并入

172、本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其程度与每篇单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指示以引用方式并入的程度相同。在以引用方式并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相冲突的情况下，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类冲突材料。